Hintergrund

Die Prognose maligner epithelialer Tumoren des Gastrointestinaltrakts hängt wesentlich vom erhobenen Lymphknotenstatus ab. Das Vorhandensein oder der sichere Ausschluss von Lymphknotenmetastasen korreliert mit der Prognose der Patienten und ist richtungsweisend für die Entscheidung zur adjuvanten Chemotherapie [24].

Die pathologisch-anatomischen Aufarbeitung von Lymphknotenpräparaten ist standardmäßig an Palpation und Sicht ausgerichtet. Diese Methode ist zeitaufwendig und abhängig vom Untersucher. Neben der konventionellen manuellen Bearbeitung gibt es eine Vielzahl von Veröffentlichungen, die Clearing-Methoden mit unterschiedlichen organischen Lösungsmitteln teilweise unter Anwendung von Siede- und Mischapparaturen beschreiben [6, 8, 23, 25]. Diese Methoden führen meistens zu einer vermehrten Anzahl untersuchter, insbesondere kleinster Lymphknoten und erhöhen damit die individuelle Prognosesicherheit [22, 27]. Der Nachteil bleibt jedoch die weiterhin durchzuführende manuelle Bearbeitung oder Nachbearbeitung. Zusätzlich ergibt sich durch die Fixierungsdauer ein Zeitverzug in der Diagnostik von bis zu einer Woche, die Lösungsmittelbelastung für die Mitarbeiter sowie die Entsorgungsproblematik. Auch eine kürzlich publizierte Ex-vivo-Methode mittels Methylenblau-Perfusion bedarf einer besonderen Bearbeitung und kurzer Transportwege [19].

Vor diesem Hintergrund haben wir eine einfache Methode zur standardisierten Aufarbeitung von Lymphknoten im Gastrointestinaltrakt entwickelt, die folgenden Anforderungen genügt:

  • komplette histologische Bearbeitung von Fettgewebe im Gastrointestinaltrakt ohne Lamellierung,

  • einfache personenunabhängige Handhabung, die auch vom technischen Personal durchgeführt werden kann,

  • Bearbeitung von Routineeingangsmaterial ohne besondere Präparation durch den Operateur,

  • kein nennenswerter Zeitverzug durch die Bearbeitung,

  • nur geringe Mehrbelastung an Material und Arbeitszeit,

  • Recycling von Lösungsmittel mit einfachsten technischen Mitteln,

  • Erhaltungszustand der Lymphknoten entspricht der Routineaufarbeitung, inklusive immunhistochemischer und molekularer Zusatzuntersuchungen.

Inzwischen wurden über 400 Operationspräparate aufgearbeitet. Die Aufarbeitungstechnik führt zur Steigerung der Quantität und Qualität des Lymphknoten-Samplings.

Material und Methoden

Das Grundproblem bei der Präparation von Lymphknoten in Fettgewebe ist die zuverlässige Darstellung kleiner und kleinster, meist kugelförmiger anatomischer Strukturen in einem großen Volumen von für die Untersuchung irrelevantem Fettgewebe.

Durch die Anwendung von Aceton werden die anatomischen Strukturen fixiert, das Fettgewebe teilweise im Eluat gelöst und gehärtet. Die anschließende Kompression entfernt das restliche Fett, von den voluminösen Lipozyten bleiben nur noch die Zellmembranen und Kerne übrig. Das Restgewebe (Pellett genannt, mit einliegenden Lymphknoten, Nerven und Gefäßen) nimmt nur noch 5–10% des Volumens/Ausgangsgewichtes ein. Das Fettgewebe wirkt gleichsam als Puffer, die Lymphknoten bleiben in ihrer Struktur erhalten. Abb. 1 skizziert das vorgestellte Lösungsprinzip.

Abb. 1
figure 1

Grundprinzip der Acetonkompression (Gefäße und Nerven sind nicht dargestellt)

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Innerhalb von 2,5 Jahren wurden 404 Operationspräparate mit der Acetonkompression analysiert. In diesem Zeitraum wurde die Methode von ersten Vorversuchen beginnend modifiziert und in Details bis zum aktuell vorgestellten Protokoll optimiert. Das Untersuchungsgut umfasste 348 Kolonresektate, 28 Magenresektate, 5 Ösophaguspräparate inklusive Barrett-Karzinom, 14 Omentum-majus-Präparate, 2 Jejunum- und Ileumpräparte, 2 Mammaresektate, 2 Neck-dissection-Präparate, 2 Perinealresektate und ein Axillaresektat. Über 90% stammten von Tumoroperationen, die übrigen Resektionen wurden bei benignen Erkrankungen (hauptsächlich Divertikulose) durchgeführt. Das Omentum majus wurde bei der Operation von Ovarialkarzinomen oder dem Verdacht auf das Vorliegen einer mikroskopischen Peritonealkarzinose gastrointestinaler Karzinome entnommen.

Prozessierung

Die Operationspräparate aus dem Gastrointestinaltrakt wurden zunächst eröffnet und inspiziert sowie ggf. aufgespannt nachfixiert. Anschließend erfolgte die übliche Präparation des Tumors mit angrenzendem Fettgewebe und die Probeentnahme für die Routineaufarbeitung. Danach wurde das Fettgewebe vom Hohlorgan sorgsam abpräpariert und Klammern oder Nahtmaterial sorgfältig entfernt. Das Fettgewebe wurde gewogen und mit einer Polyethylen- (PE-)Nagelwalze manuell über Zellstoff perforiert. Anschließend wurde das Fettgewebe in ein 6-l-Reaktionsgefäß mit kaltem Aceton (Qualität „Zur Synthese“) verbracht. Die Erhitzung bis zum Siedepunkt 56°C erfolgte in einem Standardwasserbad unter Verwendung von Siedesteinchen. Ein Hochleistungsrückflusskühler kühlte das Aceton ab (Abb. 2 a). Die Siedezeit betrug in der Regel 4 Stunden. Pro 100 g Fettgewebe wurden etwa 500 ml Aceton benötigt. Anschließend erfolgte eine Vorkompression des weitgehend transparenten Fettgewebes mit einer Handwalze aus Polyethylen auf Zellstoff. Alternativ kann auch bei Raumtemperatur gearbeitet werden, die Bearbeitungszeit beträgt dann 24 Stunden bei erhöhtem Acetonverbrauch.

Abb. 2
figure 2

a Reaktionsgefäß mit mit Rückflusskühler. b Drehdornpresse, Nagelwalze, Handwalze. c Messinghülse mit Stempel

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Abb. 3
figure 3

a Natives Fettgewebe. b Pellett nach Elution und Kompression. c Pellett in Einbettkapseln

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Anschließend wurde das Gewebe (Abb. 3 a) manuell in 2–3 cm große Gewebestücke zerteilt. Zerschneiden mit Messer oder Schere wurde vermieden, um Lymphknotenanschnitte und damit eine erhöhte Zahl von Knoten auszuschließen. Das vorgepresste Fettgewebe wurde in eine Messinghülse (Länge 10 cm, Wandstärke 3 mm, Außendurchmesser 4 cm) verbracht (Abb. 2 c). Entsprechende leichtgängige PE-Stempel verschiedener Länge standen je nach Gewebemenge zur Verfügung. Anschließend erfolgte die manuelle Kompression mit der Drehdornpresse (DDP2, Fa. Stürmer, max. Kraft 2000 kg, Abb. 2 b). Zahlreiche 2-mm-Bohrlöcher leiteten das restliche Aceton und Fett aus der Hülse ab. Das Pellett (Abb. 3 b) wurde gewogen und manuell in Einbettkapseln verbracht (Abb. 3 c) und der Routineaufarbeitung zugeführt.

Die Paraffinblöcke wurden in 2 Stufen angeschnitten, für jeden Fall wurden neben den Stammdaten dokumentiert: Fixationszeit, Feuchtgewicht, Gewicht nach Acetonbehandlung, Gewicht der Pelletts, Anzahl der Lymphknoten, Anzahl der Paraffinblöcke, Qualität der histologischen Präparate (1–6), Quotient Lymphknoten/Feuchtgewicht Anzahl Paraffinblöcke.

Statistik

Die Daten wurden fortlaufend in einer Excel©-Tabelle erfasst (Version 2007), die deskriptive statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm WinStat© (Version 2007.1) für Excel.

Recycling

Vor dem Hintergrund der Kostenersparnis und der Umweltbelastung durch Lösungsmittel wurde ein einfaches, aber sehr effektives Recycling-System für das Aceton entwickelt. Nach Abkühlung im Reaktionskolben wurde das verunreinigte Lösungsmittel in gewöhnliche PE-Gefrierbeutel eingefüllt. Diese wurden über Nacht auf –14°C abgekühlt. Das gelöste Fett fiel aus und konnte sachgerecht entsorgt werden. Das Aceton wurde mit handelsüblichen Papierfiltern gereinigt und in ein Gefäß mit Molekularsieb 0,3 nm© (Fa. Merck) verbracht und stand für einen erneuten Aufarbeitungszyklus zur Verfügung. Nach 5–6 Gefrierzyklen erfolgte die Destillation über einen Liebigkühler. Herr Prof. Dr. A. Greiner (Philipps-Universität Marburg, Makromolekulare Chemie) überprüfte mittels Gaschromatographie das Aceton und fand keine Verunreinigungen nach der Prozessierung (persönliche Mitteilung).

Immunhistochemie

Die immunhistochemischen Reaktionen wurden stichprobenartig an ausgewählten Lymphknoten mithilfe der PAP-Methode durchgeführt. Dabei kamen im Autostainer der Fa. DAKO die Antikörper gegen CD20 (Klon L26, Fa. DAKO, Verdünnung 1:2000), CD3 (Klon SP7, Fa. Neo Markers, Verdünnung 1:150), Panzytokeratine (Klon AE1/AE3, Fa. DAKO, 1:200) und Ki-67 (Klon K2, Fa. Zytomed, 1:2000) zum Einsatz.

Molekularpathologie

Die Qualität der DNA wurde an 6 verschiedenen Fettgewebeproben mit einliegenden Lymphknoten mittels einer standardisierten Kontroll-Gen-PCR durchgeführt [29].

Ergebnisse

Die Qualität der routinegefärbten histologischen Präparate wurde in 398 Fällen (98,5%) als „gut“ und „befriedigend“ eingestuft (Abb. 4 a, b). Sechs Fälle (1,5%) wurden bei mangelnder Entwässerung und entsprechenden Schnittartefakten als „ausreichend“ beurteilt. Die gut erhaltenen Lymphknoten, Gefäße und Nervenstrukturen waren zwischen dem eluierten und komprimierten Fettgewebe problemlos zu identifizieren. In Abhängigkeit von Fettgehalt, Lokalisation, aber auch neoadjuvanten Vorbehandlungen ließ sich ein Kompressionsgrad des Pellett von durchschnittlich 90% (bis 95% mit heißem Aceton) zum Feuchtgewicht erzielen (Tab. 1). Entsprechend kann die Anzahl der Paraffinblöckchen pro 100 g Fettgewebe mit 4 bis 8 abgeschätzt werden. Wenig geeignet waren Präparate mit einem ungünstigen Verhältnis zwischen Fett und Knoten (ausgedehnte Karzinose, Konglomeratknoten, periblastomatöse Entzündung).

Abb. 4
figure 4

a Lymphknoten mit Metastase (HE-Färbung, Vergr. 2:1). b Lymphknotenkapsel mit komprimiertem Fett (HE-Färbung, Vergr. 20:1). c B-Lymphozyten (PAP-Färbung, CD20-Immunhistochemie, Vergr. 20:1). d Metastase eines Kolonkarzinoms (PAP-Färbung, AE1/AE3-Immunhistochemie, Vergr. 20:1)

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Tab. 1 Kumulative Ergebnisse der Untersuchungen
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Die Anzahl der dargestellten Lymphknoten bei den Kolonresektaten genügte in allen Fällen den Mindestanforderungen der UICC („Union Internationale Contre le Cancer) von 12 [30] und lag in der Regel ein Mehrfaches darüber. Ähnliche Ergebnisse ließen sich für Magen-, Ösophagus- und Dünndarmresektate erzielen. Die Anwendung der Methode an Omentum-majus-Präparaten konnte in 2 Fällen Mikrometastasen bei Ovarialkarzinomen nachweisen. Bei zwei lipomatösen Mammaresektaten konnte nach vorangegangener R1-Situation Resttumorgewebe ausgeschlossen werden.

Nebenbefundlich konnten mehrfach Endometrioseherde, Fremdkörpergranulome, Hämagiome und Endosalpingeosen gesichert werden.

Die stichprobenartigen immunhistochemischen Reaktionen an den Lymphknoten waren in allen Fällen regelrecht (Abb. 4 c, d). Auch die durchgeführten molekularpathologischen Untersuchungen zeigten mit 100 bis 300 amplifizierbaren Basenpaaren reguläre Ergebnisse nach der Gewebeprozessierung.

Diskussion

Der Nodalstatus ist bei Karzinomen des Gastrointestinaltrakts bis heute der wichtigste bekannte Prognoseparameter. Die sorgsame konventionelle Lamellierung des Fettgewebes zur Auffindung von Lymphknoten ist Standard bei der Mehrzahl der untersuchten Operationspräparate. Untersuchungen zeigen jedoch, dass die Mindestzahl von 12 Knoten häufig nicht erreicht wird [9, 21].

Besonders schwierig gestaltet sich das Auffinden von Lymphknoten in Resektaten von neoadjuvant vorbehandelten Patienten mit entsprechend kleinen und kleinsten Lymphknoten [20]. Nur einzelne Untersuchungen beschäftigen sich mit dem möglichen Zusammenhang zwischen dem Untersucher und der Anzahl der Lymphknoten [9].

Die seit Langem beschriebenen Clearing-Techniken zur Auffindung kleiner und kleinster Knoten finden sich in der Literatur in zahlreichen Varianten und Modifikationen [1, 3, 6, 10, 12, 13, 14, 17, 22, 23, 26]. Bei diesen Untersuchungen werden im Vergleich zur konventionellen Aufarbeitung in der Regel deutlich mehr Knoten detektiert, und nicht selten werden kleinste, vorher unerkannte Metastasen gefunden. Nur wenige Autoren sehen in diesen Methoden keinen Vorteil gegenüber der konventionellen Bearbeitung [16, 17]. Auch zumeist retrospektiv-mathematische Studien zur Mindestanzahl der zu untersuchenden Knoten [5, 11] können sich nur auf detektierte Knoten anhand von statistischen Modellen stützen, unerkannte Knoten müssen unberücksichtigt bleiben. Andere Autoren empfehlen die Untersuchung von möglichst vielen Knoten [7, 9]. Eine zusammenfassende Literaturübersicht [4] unterstreicht trotz der Methodenvielfalt die Anzahl der untersuchten Lymphknoten als wichtigen Überlebensprognoseparameter bei Stadium-II- und -III-Kolonkarzinomen [30].

Trotz der offensichtlichen Vorteile der Clearing-Techniken gegenüber der lamellierenden Aufarbeitung haben sich diese außerhalb von Studien oder einzelnen Zentren nicht flächendeckend etablieren können. Als Gründe können aufwendige Apparaturen [8, 25], ein hoher Zeitaufwand bei der Prozessierung [14, 16] und der teilweise nicht unerhebliche Bedarf an Lösungsmitteln einhergehend mit der Entsorgungsproblematik und auch Belastungen am Arbeitsplatz vermutet werden. Ein weiterer sehr wichtiger Faktor ist die nach wie vor notwendige manuelle Bearbeitung oder Nachbearbeitung des Fettgewebes. Auch die an die Sentinel-Technik angelehnten Markierungen mit Farbe bedürfen neben einer besonderen Handhabung des Operationspräparates noch der manuellen Bearbeitung [19], die Lymphknotenausbeute ist mit den Clearing-Techniken vergleichbar.

Aceton-basierte Clearing-Technik

Unsere vorgestellte Methode der Acetonkompression modifiziert die Aceton-basierten Clearing-Techniken dahingehend, dass der Schritt der manuellen Dissektion des Fettgewebes zur Lymphknotensuche entfällt. Anstelle dieser zeitintensiven Suche treten die Elution und Kompression, die das Fettgewebe weitgehend entfernen und die Lymphknoten in dem erheblich reduzierten Untersuchungsvolumen unversehrt zurücklassen. Die erhebliche Volumen-/Gewichtsreduktion um bis 95% erlaubt es nunmehr, das gesamte Fettgewebe ohne vorherige manuelle Untersuchung komplett einzubetten.

Die Anzahl der zu untersuchenden Paraffinblöckchen ist zwar im Vergleich zur konventionellen Bearbeitung erhöht, es sind jedoch pro Fall selten mehr als 20 Präparate anzufertigen. Auch die Bearbeitungszeit nach der Acetonbehandlung beträgt in der Regel und bei etwas Übung akzeptable 6 bis 12 Minuten. Erfolgt die Prozessierung am Vormittag, kann das Präparat am nächsten Tag komplett befundet werden.

Die Acetonkompression kann als Kaltmethode und mit der Siedeapparatur unter besonderer Beachtung der Sicherheitsaspekte nach Anleitung und unter Aufsicht auch problemlos vom technischen Personal ohne Qualitätsverlust durchgeführt werden – ein nicht unwesentlicher Faktor vor dem Hintergrund des „knappen Faktor Pathologie“ [2]. Die Qualität der histologischen Schnitte und die immunhistochemische Reaktivität [10, 15] einschließlich der zunehmend wichtigen exemplarisch durchgeführten molekularpathologischen Zusatzuntersuchungen unterscheiden sich nicht von der konventionellen Bearbeitung. Damit ist es möglich, die mehrfach geforderte Standardisierung in der Bearbeitung von Fettgewebe [18, 28] zu realisieren. Die Methode wurde durch die Bearbeitung mit siedendem Aceton an den zunehmenden Zeitdruck der Bearbeitung adaptiert, eine Aufarbeitung bei Zimmertemperatur ist ebenfalls problemlos möglich.

Das sehr einfache Recycling des Acetons ermöglicht schließlich eine Schonung von Ressourcen und Umwelt.

Neben dem Fettgewebe gastrointestinaler Operationspräparate wurden auch 14 Omentum-majus-Präparate meist vor dem Hintergrund von möglichen Mikrometastasen untersucht, die sich in 2 Fällen verifizieren ließen. Auch lipomatöse Mammaresektate können prinzipiell bei erhaltener Histomorphologie der epithelialen und bindegewebigen Strukturen untersucht werden.

Grenzen sind der Methode bei ungünstigem Verhältnis von Fett zu untersuchenden nichtlipomatösen Strukturen gesetzt, hier fehlt die Pufferwirkung bei der Kompression, zunehmende Riss- und Bruchartefakte treten auf, und die Zahl der Paraffinblöcke nimmt deutlich zu.

Fazit für die Praxis

Die Acetonkompression erlaubt die komplette standardisierte Aufarbeitung von Fettgewebe zum Auffinden von Lymphknoten ohne vorheriges Lamellieren. Dazu wird eine einfache apparative Ausstattung benötigt. Die Qualität der Lymphknoten entspricht der konventionellen Aufarbeitung, immunhistochemische und molekularpathologische Zusatzuntersuchungen können ohne Qualitätsverlust weiterhin durchgeführt werden. In der Regel wird ein Mehrfaches der nach UICC geforderten 12 Lymphknoten gefunden. Diese Methode kann unabhängig von besonderen Voraussetzungen an fixierten Operationspräparaten auch vom technischen Personal durchgeführt werden. Sie trägt dem wichtigen Prognosefaktor Lymphknoten bei Malignomen des Gastrointestinaltrakts Rechnung und ermöglicht eine standardisierte flächendeckende Aufarbeitung der Operationspräparate.