Hintergrund

Der menschliche Darm ist Sitz einer stabilen mikrobiellen Gemeinschaft (Mikrobiom) von mehr als 100 Billionen Bakterien, aber auch einer signifikanten Anzahl von Pilzen, Viren und Archeaen, die gemeinsam mit der Schleimhaut des menschlichen Wirts ein komplexes Ökosystem bilden [1–5]. Die Anzahl an Bakterien übertrifft (vor dem täglichen Stuhlgang) die Zahl der menschlichen Zellen um das 10-Fache. Durch Ausscheidung entsteht ein wichtiger Biorhythmus (Reduktion der Bakterienzahl um den Faktor 5–10), der zur ständigen Erneuerung und Stabilisierung des Mikrobioms beiträgt. Nur ein Bruchteil des Mikrobioms ist bisher kultivierbar [6]. Das Ökosystem konstituiert sich nach der Geburt. Man nimmt an, dass es hierbei zu Selektionsprozessen kommt, die bestimmte, von außen zugeführte Bakterien in ihrer Ansiedlung (Kolonisation) unterstützen, und sich so langsam des adulten Mikrobioms bildet. Nahrungs- und andere Umwelteinflüsse spielen eine wichtige Rolle. So wurde z. B. beobachtet, dass Kinder, die nicht gestillt werden oder durch einen Kaiserschnitt zur Welt kommen, andere bakterielle Muster aufweisen als solche, die einer vaginalen Geburt bzw. Muttermilch ausgesetzt waren [7, 8].

Trotz der Dichte der Besiedlung existiert eine Reihe von Mechanismen, die es ermöglichen, dass Mikroben und Immunsystem in friedlicher Koexistenz leben. Hierzu trägt eine strikte räumliche Trennung einen entscheidenden Teil bei. Die Trennung wird durch die Präsenz einer dichten spezialisierten Mukusschicht bewerkstelligt, in die körpereigene antimikrobielle Prinzipien (z. B. antimikrobielle Peptide, Kathepsine, reaktive Sauerstoffspezies) in einem Gradient eingebunden sind [9, 10]. Hierdurch entsteht eine Art Niemandsland zwischen Wirt und Mikroben, das bei einer Reihe von entzündlichen Erkrankungen (z. B. bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, CED) durch die Bakterien überwunden werden kann. Ein weiteres Element der Koexistenz sind Toleranzmechanismen der mukosalen Immunzellen, die durch einen spezifischen Besatz an Rezeptoren oder akzessorischen Signalmolekülen, wie z. B. reduzierte Expression des MD2-Proteins, das einen Aktivator für den Lipopolysaccharid(LPS)-Rezeptor TLR4 darstellt [11], weniger reaktiv gegenüber mikrobiellen Signalen sind. Weiterhin senden kommensale Bakterien Signale aus, die in physiologischer Weise das Immunsystem dämpfen, oder sie tragen veränderte Oberflächenstrukturen, sodass sie weniger erkannt werden können [12, 13]. Dennoch ist klar, dass eine schnelle Reaktion des Immunsystems auf sich vermehrende und eindringende Pathogene ein essenzieller Bestandteil der Balance des Ökosystems ist.

Die molekulare Prägung des mukosalen Immunsystems erfolgt früh in der Kindheit

Die molekulare Prägung des mukosalen Immunsystems erfolgt früh in der Kindheit. Erste Befunde deuten auf Zeitfenster hin, in denen bestimmte bakterielle Antigenkontakte wichtig sind, um eine physiologische Differenzierung der Immunzellen (z. B. DNA-Methylierungsmuster natürlicher Killerzellen [14]) zu erlangen. Ebenso führen Auslenkungen des intestinalen Mikrobioms, z. B. nach Antibiotikatherapie, zu einer beständigen Veränderung des Antikörperrepertoires, wobei sich die sezernierenden B‑Zellen nach kurzer Zeit auch in anderen epithelialen Barriereorganen (Lunge, Haut, Brustdrüse) wiederfinden [15]. Die Besiedlung des Darms ist somit für eine ganze Reihe von Immunreaktionen auch außerhalb des Intestinaltrakts instruierend. Diese Kenntnisse sind wichtig um zu verstehen, dass neben dem aktuellen Besatz an Mikroben auch die „Lebensgeschichte“ des Ökosystems einen entscheidenden Anteil an der Ätiologie von mikrobiomassoziierten Erkrankungen haben kann. Ebenso kann bei gleichem Bakterienbesatz z. B. durch einen Barrieredefekt ein ähnliches Mikrobiom durch eine andere räumliche Anordnung ein hohes proinflammatorisches Potenzial aufweisen. Es ist klar, dass viele dieser balancierenden Faktoren heute nicht durch direkte diagnostische Tests erfasst werden können. Dennoch wird in der Zukunft dem Wirtsaspekt neben der taxonomischen und funktionellen Betrachtung der Bakterienseite eine wichtigere Bedeutung zukommen müssen, um die volle Komplexität der Physiologie des symbiotischen Zusammenlebens abzubilden.

Der Umfang der genetischen Information der intestinalen bakteriellen Gemeinschaft beträgt das 100-Fache des menschlichen Genoms [4, 16–18]. Ein signifikanter Teil dieser Information wird benötigt, um die normale Physiologie des menschlichen Darms aufrechtzuerhalten. Die Muster der Bakterien sind interindividuell variabel, aber im einzelnen Individuum trotz zahlreicher Perturbationen (Infektionen, Antibiotika) über die Zeit bemerkenswert stabil [19–21]. Die Eigenschaft, trotz äußerer und innerer Einflüsse und signifikanter Auslenkungen die Zusammensetzung stabil zu halten, wird als Widerstandfähigkeit (Resilienz) des Ökosystems bezeichnet. Es kann davon ausgegangen werden, dass das Darmmikrobiom mit der Wirtsseite ein koevolviertes symbiotisches System darstellt, das zur normalen Homöostase und Funktion des Darms beiträgt und damit eine Erhöhung der evolutionären Fitness beider Partner bedeutet. Die Diversität des Systems ist ein wesentliches Merkmal und trägt zur Widerstandfähigkeit bei. Zahlreiche Eigenschaften belegen diese Hypothese. So sorgt der Mensch für die essenzielle Energiezufuhr; die mikrobielle Gemeinschaft ihrerseits trägt zum Nahrungsmittelaufschluss, zur Vitaminproduktion und zum Fettsäurestoffwechsel bei.

Kurzkettige Fettsäuren sind hierbei ein wichtiger Kometabolit, der von bestimmten Bakterien gebildet und von intestinalen Epithelzellen als wesentliche Energiequelle genutzt wird, die aber darüber hinaus auch weitere modulatorische Funktionen z. B. auf das Immunsystem ausüben [18].

Ein wichtiges Konzept für das Verständnis der Darmflora ist der Begriff des Kernmikrobioms („core gut microbiome“). Das Konzept ist in der Annahme geprägt worden, dass es eine gemeinsame Grundausstattung des menschlichen Mikrobioms gibt, die bei jedem Menschen zu finden ist. Mit zunehmender Studienzahl zeigt sich, dass dieser Begriff weniger auf Ebene der Organismen (Kern gleicher Bakterienarten) als auf der funktionellen Ebene (genetische Ausstattung von Stoffwechselwegen innerhalb der Bakteriengemeinschaft) zutrifft und das Kernmikrobiom auch hier einer Variabilität ausgesetzt ist, die höher ist als initial angenommen [5, 22].

Die langfristige Nahrungszusammensetzung ist ein wichtiger Faktor für die individuelle Komposition der Darmflora. Wegweisende Arbeiten zeigten vor einigen Jahren, dass die Zusammensetzung des Mikrobioms nicht beliebig zustande kommt, sondern bestimmte wiederkehrende taxonomische Muster, die durch die Häufigkeit und Interaktion bestimmter Bakteriengruppen bestimmt werden, ein übergeordnetes Organisationsprinzip darstellen. Diese wurden als Enterotypen oder Enterogradienten bezeichnet [23–25]. Es konnte weiterhin herausgearbeitet werden, dass diese Muster mit der Nahrungsaufnahme und der Art der enthaltenden Energiequellen (Protein vs. Kohlenhydrate) assoziiert sind [25–27]. Auch wenn diese Stratifizierung eine wichtige konzeptionelle Erkenntnis darstellt, wurden Hinweise auf klare Krankheitszusammenhänge bisher nicht erbracht. Es muss daher betont werden, dass nach dem bisherigen Kenntnisstand weder Kernmikrobiom noch Enterotypen eine diagnostische Aussage (z. B. für das metabolische Syndrom) ermöglichen, auch wenn einige Diagnostiklabore derartige Tests anbieten.

Wiederkehrende taxonomische Muster stellen ein übergeordnetes Organisationsprinzip dar

Wie lässt sich nun die Balance einer solchen Symbiose darstellen und möglicherweise diagnostisch interpretieren? Die folgenden Paragraphen sollen kurz und kritisch die Techniken beleuchten, die zur Darstellung des Darmmikrobioms verwendet werden.

Techniken

Polymerase-Kettenreaktion und arraybasierte Tests

Techniken zur Darstellung der Darmflora mittels gezielter Amplifikation oder Hybridisierung werden in der Forschung verbreitet eingesetzt. In der klinischen Diagnostik werden die Verfahren in Deutschland als Ergänzung zu kulturbasierten Verfahren v. a. bei schwer kultivierbaren Bakterien (Mykobakterien, Chlamydien, bestimmte Anaerobier) verwendet. Sie haben ihren Stellenwert in der spezifischen Detektion von Bakterien (z. B. Pathogenen) oder Virulenzfaktoren bzw. Resistenzgenen, stehen aber noch weit hinter der klassischen Bakterienkultur zurück. Bei entsprechender Eichung des Tests kann eine absolute Quantifizierung der detektierten Kopienzahl erzielt werden, was in der Diagnostik eine wichtige Einschätzung der Relevanz des jeweiligen Befunds, z. B. in der Verlaufskontrolle einer Therapie, ermöglichen kann. Eine Vielzahl von Techniken kommt zum Einsatz. Sie reichen von der einfachen auf einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierten Amplifikation mittels spezifischer Primer, über die Real-time-PCR bis zu PCR-basierten Arrayhybridisierungen [28–36]. Ein grundsätzliches Problem aller Techniken ist, dass das Ziel vorher bekannt sein muss und dass der Nachweis der Gegenwart der DNA z. B. eines bestimmten Resistenzmerkmals mittels solcher hochsensitiver Verfahren keinesfalls die Präsenz lebender Bakterien oder den Ursprung der Resistenz in einem spezifischen bakteriellen Taxon beweist. Unvorhergesehene Bakterien oder Resistenzen bleiben solchen Verfahren unzugänglich. Ebenso ist eine Darstellung der vollen Diversität selbst mit parallelen Verfahren wie Chiparrays den sequenzbasierten Verfahren unterlegen.

Genamplifikation und -hybridisierung dienen der spezifischen Detektion von Bakterien

In der klinischen Routinediagnostik kommt auch eine Kopplung von Multiplex-PCR-Verfahren an eine anschließende massenspektrometrische Identifikation, wie Elektrosprayionisation (ESI)/Massenspektrometrie (MS), zur Anwendung, die eine höhere parallele Identifikation der enthaltenen Bakterien-DNA ermöglicht. Dieses System wird unter dem Namen IRIDICA (©Abbott Diagnostics, Abbott Park, Illinois USA) angeboten und wird als Schnelltest v. a. im amerikanischen Markt verwendet. Es ermöglicht die sensitive und spezifische Detektion von bestimmten Pathogenpanels aus Vollblut-, aber auch aus Stuhlproben. In klinischen Studien an Blut konnte gezeigt werden, dass diese Technik grundsätzlich als schnelle und wirtschaftliche Zusatzdiagnostik zum kulturbasierten Standardverfahren geeignet ist, um Infektionen bzw. antibiotische Resistenzen auszuschließen, da sie einen hohen negativen prädiktiven Wert besitzt [37–40]. Ob sich das Verfahren auch in der Stuhldiagnostik breit einsetzen lässt, um z. B. infektiöse Erregerpanels abzudecken, muss noch gezeigt werden. Es ist wahrscheinlich, dass in Zeiten von steigenden Antibiotikaresistenzen und Infektionen, die sich durch die Globalisierung und Mobilität rasch verbreiten können, PCR-basierte Techniken in der Mikrobiologie auch für Stuhlproben und Darmbiopsien eine zunehmende Bedeutung erfahren werden, da sie klinisch relevante Fragen beantworten können. Ihr Vorteil liegt hierbei v. a. in der Schnelligkeit und Sensitivität. Ob sie für bestimmte Bedingungen kulturbasierte Verfahren ersetzen können, werden nur große klinisch-epidemiologische Studien zeigen können.

Phylogenomische Methoden

Die Entwicklung der kulturunabhängigen Identifikation mittels 16S-rRNA-Genamplifikation war ein wesentlicher Meilenstein für das heutige Verständnis des Darmmikrobioms [41]. Hierbei werden bestimmte Genabschnitte der genetischen Information für die kleine Untereinheit des bakteriellen Ribosoms mittels PCR vervielfältigt und anschließend in ihrer Sequenz analysiert. Grundlage der Technik ist hierbei, dass 1) bestimmte Abschnitte des Gens bei (fast) allen Bakterien hochkonserviert vorliegen und 2) andere Bereiche zwischen bakteriellen Taxa hoch variabel und somit als „genetischer Fingerabdruck“ geeignet sind. Von diesen Bereiche liegen 9 (V1–V9) zwischen den hochkonservierten Abschnitten und können in unterschiedlichen Kombinationen mit universellen Primern amplifiziert werden. Als Sequenzanalyse kommen unterschiedliche Techniken zum Einsatz. In der klassischen Form wird die volle Länge des Gens aus einer Gesamt-Stuhl-DNA amplifiziert und in Vektoren kloniert. Entsprechende bakterielle Wirte werden nachfolgend mit der Bibliothek transformiert. Nach Vereinzelung der Klone wird die extrahierte DNA mittels Sanger-Kettenabbruchsequenzierung entschlüsselt. Da jeder Klon bei diesem Verfahren einzeln von einer Platte entnommen werden muss, ist die Herangehensweise sehr aufwendig. Resultat sind wenige (je nach Aufwand zumeist hunderte) Sequenzen, die aber alle Bereiche des Gens abdecken und somit eine sehr tiefe Identifikation des entsprechenden Bakteriums erlauben. Die erhaltene Sequenz wird mit Datenbanken abgeglichen und eine Wahrscheinlichkeit errechnet, mit der die Sequenz einem bereits bekannten Bakterium zuzuweisen ist (Abb. 1).

Abb. 1
figure 1

Schema einer 16S-rRNA-Gen-basierten Mikrobiomanalytik. PCR Polymerase-Kettenreaktion

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Einen Durchbruch hat die Methode erfahren, als die sog. Next-Generation-Sequencing(NGS)-Verfahren entwickelt wurden. Hierbei handelt es sich um Verfahren, mit denen hochparallel in einer Sequenzierreaktion bis zu Milliarden von DNA-Fragmenten gleichzeitig entschlüsselt werden. Bei der derzeitig marktführenden Methode (Sequencing by Synthesis, Illumina, San Diego, CA, USA; [42]) werden die amplifizierten 16S-Fragmente hierzu auf einer Glasoberfläche gebunden, das Signal nochmals mithilfe einer sog. Brücken-PCR verstärkt und anschließend die Sequenz durch die Inkorporierung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden und mithilfe einer hochauflösenden Kamera dargestellt. Die so erhaltenen Sequenzen sind kürzer (etwa 2-mal 200 bp) und umfassen so zumeist nur 1–2 variable Bereiche. Die Identifizierung der jeweiligen Bakterien ist somit etwas weniger genau, aber die Darstellung der Diversität des Darmmikrobioms ist viel höher und NGS ermöglicht v. a. die relative Quantifizierung der jeweiligen Bakterientaxa bei einer hohen Probenanzahl in kurzer Zeit.

Next Generation Sequencing ermöglicht die schnelle relative Quantifizierung von Bakterientaxa

Die geringere Genauigkeit führt dazu, dass Bakteriensequenzen als sog. Operational Taxonomical Units (OTU) beschrieben werden [43]. Dieser Begriff steht für den Vergleich der Ähnlichkeit der Sequenz mit hinterlegten Sequenzen bei einer Tolerierung geringfügiger Abweichungen (z. B. 3 %) und definiert so z. B. eine gegebene Sequenz, die als „OTU Bacteroides“ ausgegeben wird, als zu 97 % oder mehr übereinstimmend mit der 16S-rDNA-Sequenz, die in Bakterien der Gattung Bacteroides vorkommt. Eine Klassifizierung der genauen Bakterienart bzw. des Stamms ist mit der Methode üblicherweise nicht möglich. Wichtig ist, dass definierte Primerkombinationen und Regionen zu Schätzfehlern führen können, da sie bestimmte Bakteriengattungen weniger amplifizieren als andere [44–46]. Die Bereiche V1–2 und V3–4 haben sich in der Stuhlanalyse durchgesetzt, da sie die wichtigen bakteriellen Phyla Bacteroidetes, Firmicutes und Proteobakterien relativ gleichmäßig abdecken. Die 16S-rRNA kann auch aus RNA amplifiziert werden, hierbei werden v. a. die stoffwechselaktiven Bakterien erfasst und damit ein weiterer Rückschluss auf die Funktionalität der Darmflora ermöglicht. Zur biostatistischen Beschreibung der bakteriellen Konsortien kommen klassische Methoden der Diversitätsanalyse zur Anwendung [44, 46]. Diese beschreiben mittels verschiedener Indizes (z. B. Shannon-Index oder Chao I Richness) die Diversität in der einzelnen Probe (α-Diversität) oder vergleichen die Diversität von Proben untereinander (β-Diversität). Es muss hierbei grundsätzlich unterschieden werden, ob es sich um gewichtete oder ungewichtete Analysen handelt. Bei gewichteten Analysen wird die Abundanz der einzelnen Sequenzen in Betracht gezogen, d. h. häufige Sequenzen werden stärker bei den Vergleichen berücksichtigt. Bei ungewichteten Analysen zählt lediglich die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Sequenz; dadurch bekommen seltene Bakterientaxa eine höhere Bedeutung [47].

In der Diagnostik beginnt sich die 16S-rDNA-basierte Sequenzanalyse zu etablieren

Durch diese mittlerweile sehr stark verbreitete Analysemethodik ist eine Vielzahl von Daten über das Ökosystem Darm erhoben worden. In der Diagnostik beginnt sich die 16S-rDNA-basierte Sequenzanalyse zu etablieren. So kommen sie z. B. in klinischen Studien zu neuen Antibiotika oder zur Stuhltransplantation zum Einsatz. Ob und wie sich 16S-rDNA-basierte Verfahren zur Abschätzung eines individuellen Mikrobiomdefizits einsetzen lassen, um die Spenderauswahl zu verbessern, wird die künftige Entwicklung zeigen. Ein weiterer interessanter Bereich könnte die longitudinale Verfolgung des individuellen Darmmikrobioms sein, da sich hier aus der zeitlichen Entwicklung zusätzliche Biomarker für bestimmte Darmerkrankungen (z. B. Schubentwicklung bei CED oder Vulnerabilität für Clostridium-difficile-Infektion) entwickeln lassen könnten.

Metagenomik

Eine grundsätzlich andere Herangehensweise ist die Metagenomik. Die Methode wurde zuerst von Handelsman und Rondon verwandt [48, 49]. Diese prägten auch die Definition des Metagenoms als der „kollektiven genetischen Information eines gesamten Ökosystems“. Bei dieser Technik wird im Fall des gastrointestinalen Trakts die gesamte DNA der luminalen Mikroflora (z. B. Stuhl oder Mageninhalt) extrahiert, in gleichmäßige kleinere Stücke geschnitten und sequenziert. Hierbei kommt ebenfalls die NGS-Methode zum Einsatz, um kosten- und zeiteffizient diesen sehr großen Sequenzraum (fäkales Gesamtmetagenom: etwa 250 Gigabasen) darzustellen ([50]; Abb. 2).

Abb. 2
figure 2

Prinzip und Schritte der bakteriellen Metagenomanalyse (Flussdiagramm)

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Ein größeres Problem dieser Methode liegt in der bioinformatischen Verarbeitung der erhobenen Datenmengen, die allein in der benötigten Speicherkapazität die 16S-basierten Verfahren um mehrere Größenordnungen übertreffen. Mittels Annotationsalgorithmen werden z. B. alle potenziell kodierten Proteinbruchstücke von den einzelnen Fragmenten „übersetzt“ (in beide Richtungen und in 3 Leserahmen) und mit vorhandenen Proteinen aus Datenbanken abgeglichen. Die so erhaltenen Muster (z. B. Anwesenheit von bestimmten Enzymen wie Aminosäuresynthetasen) können quantifiziert und durch den Abgleich mit genetischer Variabilität auch taxonomisch untersucht werden („die identifizierte Tryptophansynthetase stammt aus Lactobacillus spp.“).

Ein größeres Problem liegt in der bioinformatischen Verarbeitung der erhobenen Datenmengen

Durch diese Kartierung lassen sich Rückschlüsse auf die Stoffwechselausstattung des untersuchten Mikrobioms gewinnen und in einem definierten Rahmen auch Stoffwechselflüsse (Aktivität) des Systems vorhersagen [51–56]. Eine weitere Entwicklung der Technik ist, dass aus den Daten auch individuelle Genome rekonstruiert werden können. Hierzu wird die Nukleotidabfolge und die relative Häufigkeit von Purin- und Pyrimidinbasen sowie von überlappenden Bruchstücken in Betracht gezogen [57, 58]. Mit diesem Filter werden die Stücke in kleinere Teilmengen („bins“) verbracht, die anschließend zusammengesetzt (assembliert) werden. Neben der grundsätzlichen Anwesenheit von Stoffwechselwegen kann so auch dargestellt werden, welche Schritte gemeinsam in einem Bakterium ablaufen oder welche Antibiotikaresistenzen zusammen in welchem bakteriellen Genom vorliegen.

Grundsätzliche Schwierigkeiten liegen bisher in der Untersuchung von mukosaassoziierten bakteriellen Gemeinschaften, da z. B. in Biopsien die Menge der menschlichen DNA die der Bakterien um ein Vielfaches übersteigt. Hier wird intensiv an Aufreinigungsmethoden gearbeitet, die zu einer Anreicherung der bakteriellen DNA verwendet werden können. In der Diagnostik ist auch mangels (noch) fehlender Standards in der Annotation und aufgrund der Sequenzierkosten (Minimum 300–500 € Materialkosten) ein Einsatz der Metagenomik eher perspektivisch zu betrachten. Durch die tieferen funktionellen Einblicke erscheint sie jedoch das derzeit geeignetste Verfahren, um metabolische Defizite der vorhandenen komplexen Gemeinschaften aufzuklären und den für die Rekonstitution notwendigen Cocktail an Bakterien im Sinne einer gezielten Ökotherapie vorherzusagen.

„Dual shotgun metatranscriptomics“/Metaproteom

Viele sog. Omics-Verfahren, die die genaue Auflösung der Stoffwechselräume des Darmmikrobioms zum Ziel haben, sind derzeit in der Entwicklung. Aus dieser Vielzahl seien hier 2 Techniken herausgegriffen, die eine interessante Ergänzung zu den bereits beschriebenen genomischen Verfahren darstellen. Bei der Analyse des Transkriptoms (also der kollektiven Information der transkribierten RNA) sind Verfahren zur simultanen Darstellung des Wirts- und Bakterientranskriptoms („dual shotgun transcriptomics“; [59, 60]) als besonders spannende Entwicklung zu betrachten. Hieraus kann möglicherweise der tatsächliche Kometabolismus des Systems abgelesen werden, da die Technik einen hochaufgelösten Schnappschuss der physiologischen Zustände beider Seiten der Symbiose ermöglichen. Ähnlich der Metagenomik wird bei dieser Analyse die (im Fall des Darms mukosale) Gesamt-RNA in chemisch kleine Stücke geschnitten, die anschließend in cDNA übersetzt und mittels NGS analysiert werden. Eine Annotation und Quantifizierung erfolgt analog zum Metagenom. Auch hier sind einige methodische Schwierigkeiten, wie die unterschiedliche Stabilität und Abundanz der menschlichen und Bakterien-DNA, die Abreicherung von ribosomaler RNA oder die unterschiedliche Extraktionseffizienz aus bestimmten bakteriellen Taxa, noch zu überwinden. Insgesamt erscheint aber das Verfahren durchaus als weiterer wichtiger Schritt, der ein übergeordnetes Verständnis des zeitlich und räumlich komplexen Ökosystems Darm ermöglicht.

Die simultane Darstellung des Wirts- und Bakterientranskriptoms ist eine spannende Entwicklung

Eine weitere wichtige Entwicklung ist von der massenspektrometrischen Untersuchung der aus dem Gesamtmikrobiom gewonnenen Proteinextrakte („metaproteomics“ [61]) zu erwarten. Hierbei werden komplexe Mischungen von Proteinen zunächst durch enzymatischen Verdau in kleine Peptide aufgeschlüsselt und mittels säulenchromatographischer Methoden in Fraktionen zergliedert, die anschließend durch massenspektrometrische Verfahren analysiert werden. Die Kopplung von verschiedenen MS-Analysen (Tandem-MS) erlaubt die Aminosäuresequenzidentifikation der Peptide durch Datenbankabgleich der erhobenen Massen der Fragmente. Das Verfahren wird bei Proben, bei denen die Herkunft der Proteine klar definiert ist (z. B. menschliche Zellkultur), schon seit längerem und äußerst erfolgreich eingesetzt. Ein breiterer Einsatz in der molekularen Mikrobiomanalytik der Darmflora ist bisher an der komplexen Bioinformatik gescheitert, da die identifizierten Molekulargewichte der Peptide und deren Fragmente auf eine unbekannte Anzahl von Bakteriengenomen bezogen werden müssen. Mit wachsender Anzahl der in Datenbanken deponierten Genome aus Darmbakterien und der Kombination der Technik mit taxonomischer Klassifikation (über 16S-rDNA-Verfahren) wird jedoch die Bedeutung der proteomischen Analyse stark ansteigen, da sie den direkten Blick auf die funktionale Ebene ermöglicht. Dazu gehört auch die Entschlüsselung posttranslationaler Modifikationen (wie Phosphorylierung oder Glykosylierung). In Modellen (z. B. Entzündungs- oder Infektionsmodellen in der Maus) kann sie darüber hinaus mit Verfahren wie der stabilen Isotopmarkierung kombiniert werden [62, 63], die eine Erkenntnis und Quantifizierung von Stoffwechselflüssen erlaubt.

Langzeiteffekte von Stuhltransplantation

Auch wenn Fallbeispiele des therapeutischen Effekts von Stuhltransplantation (Fäkaltransplantation, FT) bei infektiöser-nekrotisierender Enterokolitis schon seit über 50 Jahren beschrieben worden sind [64], hat die Überlegenheit der FT bei rekurrierender Kolitis durch Clostridium-difficile-Infektion in einer randomisierten Studie zu einer starken Zunahme der Beachtung dieser Therapie geführt [65]. In Deutschland ist dies z. B. durch die Gründung eines Registers dokumentiert, das den Großteil der Behandlungen dokumentiert [66]. Auch wenn bei klarer Indikationsstellung und korrekt durchgeführter Spenderauswahl die Risiken einer solchen Behandlung bisher vergleichsweise gering anzusetzen sind, ist jedoch klar zu betonen, dass ein Fremdstuhltransfer nie ein definiertes Arzneimittel, sondern immer eine relativ unstandardisierte therapeutische Prozedur bleiben wird.

Fremdstuhltransfer wird immer eine relativ unstandardisierte therapeutische Prozedur sein

Die molekularen Methoden, die in den vorangegangenen Abschnitten diskutiert wurden, sind geeignet, grundsätzlich aufzuklären, welche Mechanismen hinter der Verdrängung des infektiösen Erregers stehen. Es ist wahrscheinlich, dass metabolische Konkurrenz oder andere kompetitive Ereignisse eine wichtige Rolle spielen. Interessante Arbeiten deuten daraufhin, dass auch aufbereiteter Eigenstuhl oder steril filtrierter Stuhl (d. h. FT ohne Bakterien) einen ähnlichen therapeutischen Effekt haben könnten [67, 68]. Diese Befunde könnten daraufhin deuten, dass die nötige Perturbation des unbalancierten Ökosystems im Fall von Clostridium (C.) difficile viel weniger gezielt ablaufen muss und dass es möglicherweise weniger um die „Verpflanzung“ eines Ökosystems geht, als um einen adäquaten Umweltreiz, der zur Reformatierung der vorhandenen Flora führt.

Es ist wahrscheinlich, dass dieser Effekt nur für den sehr spezifischen Fall C. difficile gilt, da es sich um eine opportunistische Infektion handelt, die nur unter ganz bestimmten Rahmenbedingungen wirksam werden kann. Derzeit wird FT für eine ganze Reihe von Krankheiten (z. B. metabolisches Syndrom, CED) als eine mögliche Behandlungsform diskutiert. Es zeichnet sich ab, dass hier das Ansprechen stärker vom Spender abhängt [67] und möglicherweise Wiederholungsbehandlungen notwendig sind. Daher wird es wichtig sein, systematische diagnostische Studien durchzuführen, die den Einfluss von FT auf das Empfängermikrobiom untersuchen [69–72]. Phylogenomische Verfahren und Metagenomik werden einen wichtigen Beitrag für das Verständnis leisten, wie lange und in welcher Art Spenderorganismen nachzuweisen sind und wie die Besiedlungsgeschichte von derart veränderten Ökosystemen tatsächlich aussieht.

Die Übertragung potenzieller nichtvorhersehbarer Risiken durch Fäkaltransfer ist ein relevantes Thema

Derzeit ist die Übertragung von potenziellen nichtvorhersehbaren Risiken durch wiederholte FT ein relevantes Thema. Letztlich kann aber auch nur ein molekulares Verständnis des Therapieerfolgs dazu führen, dass gezielte Ökotherapien entwickelt werden können. Begreift man das Darmmikrobiom und den Darm als kometabolisches System, das insgesamt erkrankt, kann es durch die Darstellung der Stoffwechselzustände/-ausstattung über die bereits genannten Verfahren zu einer diagnostischen Interpretation der komplexen Störung kommen, die eine rationale Therapie über definierte Mischungen von Bakterienstämmen mit den fehlenden Eigenschaften ermöglicht.

Beispiel der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen

Die CED werden als Erkrankungsgruppe mit einer klaren ätiologischen Beteiligung des Darmmikrobioms betrachtet [73, 74]. Bei gleichzeitig höherer Gesamtzahl der Bakterien kommt es zu einem Verlust der natürlichen Barrierefunktion des Epithels, zu einer Reduktion der Dicke der Schleimschicht und zu einer vermehrten Präsenz von Bakterien in Epithelzellen und Immunzellen in der Mukosa [75], die die aberrante Immunreaktion mitverursachen. Klinisch zeigt sich dies z. B. durch das Abklingen entzündlicher Symptome nach der Diversion des Fäkalstroms durch Stomaanlage im aboralen Schenkel, wodurch die Bakterienzahl drastisch reduziert wird. Zahlreiche 16S-rDNA-basierte Untersuchungen haben gezeigt, dass es bei CED zu einer Reduktion der Diversität der fäkalen, aber auch des mukosaassoziierten Mikrobioms kommt [76–80]. Auf tieferer phylogenetischer Ebene findet sich insbesondere beim Morbus Crohn eine relative Verminderung von γ‑Proteobakterien, Roseburia, Ruminococcaceae und Faecalibacterium prausnitzii. Bei der Colitis ulcerosa wurde wiederholt ein Anstieg von sulfatreduzierenden δ‑Proteobakterien gezeigt, der auch von der entzündlichen Aktivität abhängig war. Diese Merkmale finden sich jedoch keineswegs in allen Patienten und hängen ebenfalls von der geographischen Herkunft bzw. Ernährung der Probanden/Patienten ab [81]. Als Biomarker sind daher bisher diese Verfahren nicht geeignet, um z. B. die Diagnose CED zu untermauern. Ebenso ist es wichtig, dass in keiner dieser Untersuchungen ein echtes Pathogen im Sinne der Koch-Postulate gezeigt werden konnte. Auch in metagenomischen Untersuchungen zeigte sich eine Reduktion der nichtredundanten genetischen Informationsmenge („gene count“) des Darmmikrobioms [82–84]. Hier muss jedoch betont werden, dass tiefergehende metagenomische Analysen in großen Fallzahlen noch fehlen und somit über das tatsächliche metabolische Defizit wenige Aussagen getroffen werden können. Es besteht die Hoffnung, dass hierdurch ein besseres Verständnis des tatsächlichen funktionellen Beitrags der intestinalen Mikroflora zum aktiven Entzündungsprozess erreicht werden kann.

Die Veränderung der Diversität findet sich auch – wenn in geringeren Ausmaß – bei erstgradigen Verwandten und stärker bei dem gesunden Geschwisterteil diskordanter eineiigen Zwillinge, aber nicht bei Menschen, die im gleichen Haushalt wie CED-Patienten leben [85]. Dies deutet daraufhin, dass ein Teil der Mikrobiomveränderungen genetisch determiniert sein könnte. Somit wäre die Veränderung der Darmflora zumindest teilweise bereits vor Ausbruch der Erkrankung vorhanden und könnte so auf eine mögliche Manifestation der Erkrankung ursächlich einwirken. In verschiedenen Experimenten, die auf Mauslinien mit veränderten Genen, die Risikolozi für CED darstellen, beruhen, konnte gezeigt werden, dass durch diese Manipulation die Zusammensetzung des Darmmikrobioms gestört wird. Für Schlüsselgene, wie das NOD2-Rezeptor-Gen oder das Autophagiegen ATG16L1 (beides Risikogene für Morbus Crohn), konnte nachgewiesen werden, dass die Veränderungen zu einem erhöhten proentzündlichen Potenzial der intestinalen Flora führen. Dies kann unter definierten Bedingungen sogar auf normale (genetisch unveränderte) Mäuse durch das gemeinsame Halten in einem Käfig („co-housing“) übertragen werden [86, 87]. Bestimmte Verhaltensweisen von Mäusen (habituelle Koprophagie, damit permanenter Keimtransfer) mögen diese Transmissibilität stark begünstigen, jedoch zeigen die Experimente, dass „entzündliche“ Information grundsätzlich im Mikrobiom gespeichert sein kann und somit die Veränderungen nicht nur Ausdruck eines entzündeten Ökosystems sind, sondern die Entzündung ursächlich mitbedingen können.

Ausblick

Weitere Studien, die sich integrativ der Elemente molekularer Mikrobiomdiagnostik bedienen und den Übergang von Gesundheit zu Krankheit z. B. in humanen „kindred cohorts“ oder in longitudinalen Verläufen analysieren, könnten daher wegweisende Erkenntnisse liefern, welche Veränderungen des Mikrobioms früh und daher möglicherweise noch beeinflussbar vorliegen und welche geteilten Stoffwechselwege der Symbiose im Darm hierbei gestört werden. Erste Analysen in Biopsien von CED-Patienten, die mit infektiös-entzündeten Patienten verglichen wurden, deuten auf einen Verlust von koordiniertem Aminosäuremetabolismus [88], Fettsäureoxidation und auf eine Entkopplung des Kometabolismus zwischen Wirt und Mikroben hin [89]. Ähnliche Veränderungen könnten sich auch bei anderen mikrobiomassoziierten Erkrankungen finden. Die Komplexität der für diese Untersuchungen notwendigen Kombination von Datenqualitäten ist hoch. Letztlich wird sich aber nur mit einer derartigen Analysemethodik zeigen, ob tatsächlich Biomarker identifiziert werden können, die den spezifischen Bedarf der Rekonstitution des gestörten Ökosystems aufzeigen. Aus bisherigen klinischen Studien zu FT bei CED oder metabolischem Syndrom ist offensichtlich, dass – anders als bei C. difficile – eine hohe Spenderabhängigkeit des therapeutischen Erfolgs existiert.

Mögliche individuelle Mikrobiomstörungen müssen personalisiert behandelt werden

Dies deutet möglicherweise auf individuelle Störungen der metabolischen Eigenschaften des jeweiligen Mikrobioms hin, die personalisiert und präzise behandelt werden müssen. Ein nachhaltiger Erfolg einer Bakteriotherapie bei komplexeren Krankheitsbildern wie CED kann daher wohl nur durch eine stammbasierte Rekonstituion von komplexen Gemeinschaften (Ökobiotika) erfolgen, bei der klare molekulare Eigenschaften übertragen werden. Weder die diagnostischen noch die mikrobiologischen Voraussetzungen für eine solche Therapie sind derzeit vorhanden. Mit der kommerziell angebotenen Dysbiosediagnostik und konventionellen Probiotika hat ein solcher Ansatz keine nennenswerte Ähnlichkeit. Der derzeitige „Mikrobiomhype“ wird sich daran messen lassen müssen, ob sich das gewonnene Wissen über ein komplexes System derart in klinisch-relevante Algorithmen übersetzen lässt.

Fazit für die Praxis

  • Das Darmmikrobiom setzt sich aus einer Vielzahl von Mikroorganismen zusammen, die gemeinsam mit der menschlichen Schleimhaut ein komplexes Ökosystem bilden.

  • Zur nukleinsäurebasierten Analyse stehen Hochdurchsatztechnologien, wie Arrayhybridisierungen und Next Generation Sequencing, teilweise gekoppelt an eine Massenspektrometrie, zur Verfügung. Diese finden auch bei phylogenomischen Methoden wie z. B. bei der 16S-rDNA/-rRNA-Amplifikation ihre Anwendung. Mithilfe massenspektrometrischer Analysen von Proteinextrakten können Aussagen zum Metaproteom getroffen werden.

  • Der Mikrobiomtransfer durch Spenderstuhl wurde bisher erfolgreich bei Infektionen mit Clostridium difficile angewendet. Weitere Erkrankungen, wie z. B. metabolisches Syndrom und CED, werden als Indikation diskutiert.

  • Es ist zu erwarten, dass das molekulare Verständnis des Mikrobioms zukünftig sowohl die diagnostischen als auch die therapeutischen Möglichkeiten verschiedener Erkrankungen signifikant verbessern wird.