Zum Zeitpunkt der ersten, oft unspezifischen Beschwerden liegt bei Patientinnen mit einem Ovarialkarzinom meist bereits ein fortgeschrittenes Stadium vor. Obwohl ca. 80 % auf die primäre Chemotherapie ansprechen, kommt es bei 60–80 % dieser Patientinnen zu einem Rezidiv [18]. Experimentelle Untersuchungen zeigen, dass nur ein kleiner Anteil der Tumorzellen, und zwar die sogenannten Tumorstammzellen, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Chemotherapieresistenz und Rezidiven spielen. Nachfolgend werden das Tumorstammzellmodell, Methoden der Selektion und Anreicherung von Tumorstammzellen und der aktuelle Stand der translationalen Forschung dargestellt.

Pathogenese des Ovarialkarzinoms

Ungeachtet eines in den letzten Jahren signifikanten Erkenntnisgewinns zur Ätiologie und Pathogenese des Ovarialkarzinoms bleiben noch viele Fragen offen. Neben einer auf adulten Stammzellen basierenden Hypothese werden noch weitere, sich z. T. gegenseitig beeinflussende Theorien diskutiert, die im Zusammenhang mit der Ovulation, den Einflüssen von Hormonen (Gonadotropine, Östrogene und Androgene), aber auch Entzündungen bzw. Infektionen stehen. Etwas genauer ist das Wissen über die möglichen Ursprungszellen bzw. speziell den Ort der Tumorbildung.

Gewebespezifische Stammzellen sind für den Erhalt der Gewebehomöostase und für Reparaturvorgänge unentbehrlich [8], wobei insbesondere das Ovar durch den ovariellen Zyklus ständig Veränderungen unterliegt. Der Charakter dieser gewebespezifischen Stammzellen wurde in vielen Geweben wie beispielsweise im Magen, Darm und Gehirn umfangreich untersucht [8, 38]. Zum Ovar existieren bisher nur sehr wenige Untersuchungen, die eine Subpopulation von Stamm- bzw. Progenitorzellen im ovariellen Oberflächenepithel („ovarian surface epithelium“, OSE) nachgewiesen haben [14, 39]. Eine weitere Art im Ovar ansässiger Stammzellen sind die Keimlinienstammzellen. Diese sind in der Lage, postnatal nicht nur unreife Oozyten, sondern auch neue fertilisierungskompetente Oozyten, sogar mit Nachkommen, hervorzubringen [47]. Dies wurde durch Transplantationsuntersuchungen an Mäusen gezeigt und stellt das Dogma einer bei Geburt fixierten maximalen Anzahl an Keimzellen bei Säugetieren infrage.

Ovar als Ausgangsort der Karzinomentwicklung

Im Mittelpunkt der Diskussion über die möglichen Ursprungszellen eines Ovarialkarzinoms steht zunächst die Frage nach der Herkunft des Epithels in den ovariellen Inklusionszysten als einem wahrscheinlichen Ausgangsort der Karzinomentwicklung, da klinisch ein Teil der Tumoren als ovarielle Zysten ohne extraovarielle Herde vorliegt. Im Rahmen von Ovulationen oder auch anderen Prozessen wie beispielsweise Entzündungen kommt es zum Aufbrechen der Ovaroberfläche mit Invagination von OSE und/oder normalem Tubenepithel der eng benachbarten Fimbrien. Diese Zellversprengung von Tubenepithel ist nicht ungewöhnlich, ebenso wie auch eine Implantation auf dem Peritoneum oder in Lymphknoten auftreten kann (Endosalpingiose). Die Auskleidung der Inklusionszysten kann so morphologisch entweder flachen bis kubischen Mesothelzellen oder hochprismatischem Flimmerepithel (sekretorische und zilientragende Zellen) entsprechen (Abb. 1; [42]).

Abb. 1
figure 1

Kortikale Inklusionszysten. a Übersichtsvergrößerung sog. kortikaler Inklusionszysten in der ovariellen Rinde mit unterschiedlicher Lumenweite. b Stärkere Vergrößerung mit einem nichtpolymorphen, an Tubenepithel erinnernden Zylinderepithel mit mehrheitlich zilientragenden Zellen und einzelnen sog. sekretorischen Zellen. c Kortikale Inklusionszyste mit flacher, an Mesothel erinnernder Auskleidung

Full size image

Eine Differenzierung des mesothelialen oder des häufigeren tubaren Phänotyps ist prinzipiell mittels Calretinin und PAX8 immunhistochemisch möglich, wobei man jedoch davon ausgehen muss, dass durch metaplastische Veränderungen, bedingt durch Einflüsse der stromalen Mikroumgebung, das inkludierte OSE auch den Marker des tubaren Phänotyps exprimieren kann [4]. Die Fähigkeit zur Metaplasie einer Zelle setzt Stammzelleigenschaften, einschließlich der Pluripotenz, voraus [4]. Vergleichende Analysen der Genexpressionsprofile von Zellen des Oberflächenepithels unauffälliger Ovarien und von serös-papillären Adenokarzinomen von jeweils 12 Patientinnen ergaben über 2000 signifikant differenziell exprimierte Gene, die einer Vielzahl von molekularen Signalwegen zugeordnet werden konnten [11].

Das OSE zeigte eine hohe Expression von Genen (TGFB/BMP, TGFBR, Antagonisten für WNT und Hedgehog), die in Prozesse involviert sind, welche Stammzellen im Stadium der Quieszenz halten (OSE als interovulatorische Stammzellnische). Immunhistochemische Untersuchungen unauffälliger Fimbrien und Ovarien (jeweils n = 21) mit den Stammzellmarkern NANOG, SFRP1, LHX9, ALDH1A1 und ALDH1A2 lassen die Schlussfolgerung zu, dass sowohl das ovarielle als auch das tubare Epithel das Potenzial für eine maligne Transformation haben und liefern eine Erklärung für die charakteristische Lokalisation der tubaren Vorläuferläsionen im distalen Teil der Fimbrien [5]. Andere Untersuchungen mit den Markern LHX2 und LHX9 festigen die Annahme, dass asymmetrische Zellteilung im OSE stattfindet [11]. Neben den Genexpressionsuntersuchungen unterstützt außerdem die gleiche embryologische Herkunft des OSE sowie der Müller-Gänge aus dem Zölomepithel die Möglichkeit einer Müller-artigen Differenzierung der ovariellen Zellen und damit die Fähigkeit zur Ausbildung der verschiedenen Tumorsubtypen (serös, endometrioid, muzinös [4]).

In Zellkulturuntersuchungen humaner OSE konnte eine Transformation in hochinvasive Neoplasien, welche undifferenzierten „high grade“ und „low grade“ ovariellen Karzinomen glichen (nie jedoch Mesotheliomen), induziert werden [4]. Das OSE hat demnach prinzipiell das Potenzial zur Tumorbildung, bevorzugt innerhalb der Inklusionszysten, auch wenn bisher der Nachweis von Vorläuferläsionen nur in wenigen Ausnahmefällen gelang [30, 33].

Tuben als Ursprungsort der Tumorbildung

Für die Tuben als möglichen Ursprungsort der Tumorbildung sind die Ergebnisse morphologischer Untersuchungen entscheidend, die insbesondere an prophylaktischen Salpingoopherektomiepräparaten bei Patientinnen mit genetischer Prädisposition durchgeführt wurden. Entsprechend dem dualistischen Modell der Pathogenese des Ovarialkarzinoms werden nach morphologischen, molekularbiologischen und klinischen Merkmalen die Typen I und II unterschieden. Für die Mehrheit der „high grade“ serösen Ovarialkarzinome des Typs II geht man sicher davon aus, dass sie aus eindeutigen Vorläuferläsionen in den Tuben, und dort insbesondere im Fimbrientrichter, hervorgehen („serous tubal intraepithelial carcinoma“, STIC, und deren Vorläufer p53-Signatur und „serous tubal intraepithelial lesion“, STIL [19]). Bei der weiteren STIC-Progression invadieren die Zellen das Tubenstroma oder werden abgetragen und gelangen auf die Ovaroberfläche und das Peritoneum oder auch in den Uterus und entwickeln sich zu „high grade“ serösen Karzinomen.

Aktuelle Untersuchungen zeigen, dass auch Ovarialkarzinome vom Typ I („low-grade“ serös) und deren Vorläuferläsionen wie Borderlinetumoren möglicherweise von einer primären Läsion der Tubenmukosa, einer papillären tubaren Hyperplasie („papillary tubal hyperplasia“, PTH), ausgehen und diese dann sekundär Ovar und Peritoneum befällt (Abb. 2; [20, 42]).

Abb. 2
figure 2

Tubare Vorläuferläsionen des serösen Ovarialkarzinoms. a, b, c Seröses In-situ-Karzinom der Tube (STIC) mit Ersatz des normalen Tubenepithels durch ein polymorphes, hyperchromatisches seröses Epithel (a) mit starker proliferativer Aktivität (b, Ki-67) und starker diffuser Färbung gegenüber p53 (c). d, e Papilläre tubare Hyperplasie (PTH): fein aufgegliederte Tubenschleimhaut mit zahlreichen papillären Formationen (d), filigran gegliederte Schleimhaut mit isoliert im Lumen liegender Papille (e). STIC „serous tubal intraepithelial carcinoma“

Full size image

Für den endometrioiden und klarzelligen Subtyp des Ovarialkarzinoms existieren epidemiologische, histopathologische und molekularbiologische Studienergebnisse, die einen Ursprung in Endometrioseherden nahelegen [23]. Diese Erkenntnisse zeigen zusammenfassend, dass Gewebestammzellen bei der Tumorinitiierung eine Rolle spielen und Ovarialkarzinome im sogenannten Müller-Epithel und seltener auch im OSE ihren Gewebeursprung haben.

Historischer Hintergrund

Basierend auf den Erkenntnissen der hämatopoetischen Zelldifferenzierung entstanden die ersten Arbeiten zu Tumorstammzellen („cancer stem cells“, CSC) in der Hämatoonkologie. Zuerst zeigten Lapidot et al. [21] und danach Bonnet u. Dick [10], dass die Fähigkeit, humane Leukämien auf immunodefiziente Mäuse („nonobese diabetic/severe combined immunodeficient“, NOD/SCID) zu übertragen, einer kleinen Population von Tumorzellen vorbehalten ist, die wie somatische Stammzellen CD34+/CD38− exprimieren. Diese Zellen bildeten eine Fraktion von nur < 1/10.000 Leukämiezellen, wogegen vielfach höhere Zahlen von Zellen anderen Phänotyps nicht tumorigen waren [10].

Ein weiterer Meilenstein gelang Al-Hajj et al. [2] mit dem erstmaligen Nachweis einer CD44+/CD24−/lowLineage−-Zellpopulation bei einem soliden Tumor, dem Mammakarzinom. Schon 100 dieser Zellen, die insgesamt 1–10 % der Gesamtzellpopulation ausmachten, konnten in einer NOD/SCID-Maus ein Mammakarzinom hervorrufen, wogegen mehrere 10.000 Zellen ohne diese Oberflächenmerkmale nicht zu einem Tumorwachstum führten.

Die erste Arbeit zur Isolierung und Identifizierung von CSC beim Ovarialkarzinom wurde 2005 publiziert. Bapat et al. [6] identifizierten Zellklone mit Stammzelleigenschaften im Aszites einer Patientin mit einem serösen Ovarialkarzinom im Stadium FIGO IV mittels Sphäroidassay und bewies die Tumorigenität durch Xenotransplantation. Bereits ein Jahr später wiesen Szotek et al. [40] in ovariellen Tumorzelllinien von Mäusen mit dem DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 eine Subpopulation von Tumorzellen nach, die Eigenschaften von CSC besitzen. Diese Zellen der sogenannten „side population“ führten nach Injektion in das Fettgewebe einer thymusaplastischen Maus schneller als solche, die nicht als „side population“ eingestuft wurden, zu messbarem Tumorwachstum. Die Isolierung und Charakterisierung von Tumorzellen mit Stammzelleigenschaften aus einer humanen ovariellen Tumorzelllinie gelang Wang et al. [44] mithilfe des Wachstums in multizellulären Sphäroiden. An diesen Zellen erfolgte auch eine erste klinische Anwendung mit Testung der am häufigsten beim Ovarialkarzinom verwendeten Chemotherapeutika.

Die unterschiedliche Nomenklatur auf diesem Gebiet kann zu Verwirrung führen. Zellen wurden häufig nach ihrer Funktion benannt (z. B. tumorinitiierende oder -propagierende Zellen, stammzellähnliche Zellen, therapieresistente Zellen), bis sich der übergreifende Terminus „Tumorstammzellen“ gegenüber den Einzelfunktionen beschreibenden Namen durchgesetzt hat. Aufgrund von Fortschritten im Bereich der Stammzellbiologie und der Entwicklung neuer Tiermodelle hat die Tumorstammzellhypothese in den letzten Jahren starken Auftrieb erhalten.

Die Modelle der Karzinogenese

Zur Verdeutlichung der Karzinogenese werden hauptsächlich 2 Modelle diskutiert, welche die Tumorinitiierung, die heterogene Struktur und die Merkmale der malignen Progression auf der Basis verschiedener Zelltypen erklären. Die Mutationshypothese führte zunächst zur Entwicklung des stochastischen Tumormodells. Dieses Modell besagt, dass ein maligner Tumor seinen Ausgang in prinzipiell jeder Zelle eines Gewebes nehmen kann. Durch eine Akkumulation kritischer Mutationen entsteht der maligne Phänotyp. Bedingt durch die zunehmende genetische Instabilität bildet sich dann ein Tumor bestehend aus heterogenen Tumorsubklonen (Abb. 3 und Abb. 4 a). Die Tumorzellen und der daraus resultierende Tumor zeigen vereinfacht die biologischen Fähigkeiten, die von Hanahan u. Weinberg [15, 16] 2000 und 2011 als „hallmarks of cancer“ publiziert wurden.

Abb. 3
figure 3

Stochastisches Modell. Das Mehrstufenmodell der Karzinogenese geht von einer sequenziellen Akkumulation einer Kombination kritischer Mutationen (rote Pfeile) aus, wobei initial prinzipiell alle Zellen eines differenzierten Gewebes ganz zufällig Ausgangspunkt sein können. Durch einen natürlichen Selektionsprozess, bei dem nur die überlebensfähigsten Zellen einen Wachstumsvorteil erfahren, kommt es zum Erwerb tumorigener Eigenschaften (Fähigkeiten zur Tumorbildung) und damit der Generierung der eigentlichen Tumorzellen mit der Eigenschaft zur Selbsterneuerung (kreisförmiger Pfeil). Phänotypisch zeigen die Tumorzellen beispielsweise eine zunehmende Dedifferenzierung (durch Änderung der Zellfarbe dargestellt). Die genetische Instabilität und die unkontrollierte Proliferation erlauben nun im Rahmen der malignen Progression die Addition zusätzlicher Mutationen mit weiterer Veränderung des Genoms und führen damit zur Ausbildung unterschiedlicher zellulärer Subklone mit speziellen Eigenschaften (Tumorheterogenität durch verschiedene Zellfarben und unterschiedliche Anzahl der Mutationen im Kern verdeutlicht)

Full size image
Abb. 4
figure 4

Besonderheiten der Struktur von Primärtumor, Metastasen und Rezidiven nach beiden Modellen. a, b Primärtumorstruktur – beim stochastischen Modell (a) besteht der Tumor aus einer heterogenen Mischung aus unabhängigen Subklonen; beim Tumorstammzellmodell (b) ist die intratumorale Heterogenität hauptsächlich bedingt durch eine Zelldifferenzierung (Differenzierungshierarchie). c, d Ursprung und Struktur von Metastasen – nach dem stochastischen Modell (c) ist prinzipiell jede Tumorzelle zur Metastasierung fähig. Im hierarchischen Modell (d) besitzen nur die Tumorstammzellen (CSC) ein metastatisches Potenzial, während andere vom Primärtumor gelöste Zellen der Apoptose unterliegen (nichttumorigene Zellen). Die Struktur der korrespondierenden Metastasen zeigt dementsprechend einen deutlichen Unterschied zur Primärtumorstruktur (c) oder ist durch das gleiche Differenzierungsprogramm eher ähnlich (d). e, f Therapiebedingte Tumorveränderungen und Ursachen der Rezidivierung (ohne Berücksichtigung der Akkumulation weiterer Mutationen, die den Grad der genetischen Heterogenität erhöhen) – einige zelluläre Subpopulationen können durch die Ausbildung von Resistenzmechanismen eine Systemtherapie überleben und werden damit selektiert (e). Beim Tumorstammzellmodell weisen nur die CSC Resistenzmechanismen auf und können die aktuell eingesetzte Systemtherapie überstehen (f links). Der Rezidivtumor gleicht dem Primärtumor. Ziel aktueller Forschungen ist es, selektive Therapieformen gegen die CSC zu etablieren, die dann zu einer konsekutiven Reduktion der anderen Tumorzellen führen oder mit einer herkömmlichen Therapie kombiniert werden können (f rechts)

Full size image

Normalgewebe zeigt einen Aufbau mit hierarchischer Struktur verschiedener Zellen: Nicht alle Zellen haben die gleichen Fähigkeiten, sondern nur Stammzellen besitzen die Eigenschaft der Selbsterneuerung und ein Differenzierungspotenzial zur Umwandlung in verschiedene Zelltypen. Sie sind Ausgangspunkt neuer Stammzellen und Progenitorzellen (Vorläuferzellen), aus denen differenzierte Zellen hervorgehen. Diese hierarchische Organisation liegt dem Tumorstammzellmodell zugrunde (Abb. 5). In diesem zweiten Modell geht man davon aus, dass nur die Gewebestammzellen die kritischen Mutationen anhäufen können. Aus ihnen können durch asymmetrische Teilung eine zur Stammzelle identische Tochterzelle mit einem identischen Proliferations-, Expansions- und Differenzierungspotenzial und eine Progenitorzelle entstehen, die keine Selbsterneuerungseigenschaften mehr aufweist und in einem hierarchischen Prozess weiter proliferiert und differenziert. In Einzelfällen können auch Gewebeprogenitorzellen die Selbsterneuerungseigenschaft wiedererlangen und so zum Ausgangspunkt einer Tumorentwicklung werden [13]. Die sich entwickelnde Tumorstruktur zeigt demnach eine hierarchische Gliederung und ist in Abb. 4 a, b vergleichend mit der heterogenen Tumorstruktur des stochastischen Modells dargestellt. Die CSC haben im Unterschied zu den Gewebestammzellen die Fähigkeit zur homöostatischen Kontrolle des Gewebeaufbaus, also der Balance zwischen Proliferation und Apoptose sowie zwischen Differenzierung und Selbsterneuerung, verloren und zeigen eine deregulierte Proliferation und Expansion sowie oft ein geringeres Differenzierungspotenzial. Die Merkmale der CSC sind in Tab. 1 zusammengefasst.

Abb. 5
figure 5

Tumorstammzellmodell. In diesem Modell ist die sequenzielle Akkumulation von Mutationen auf „Gewebestammzellen“ beschränkt, die bereits die Eigenschaft zur Selbsterneuerung besitzen (rote Zellen mit kreisförmigem Pfeil). In seltenen Fällen können auch Progenitorzellen (braune Zellen) oder sogar differenzierte Zellen durch (mutationsbedingte) Reprogrammierung die Selbsterneuerungseigenschaft wiedererlangen. Die so entstandenen Tumorstammzellen können sich durch asymmetrische Teilung einerseits selbst erhalten und andererseits in weiter differenzierte Tumorzellen entwickeln. Sie können sich aber auch durch symmetrische Teilung weiter vermehren und im Lauf der malignen Progression zusätzliche Mutationen erwerben. Im Vergleich zum Normalgewebe zeigen die der asymmetrischen Teilung nachgeordneten Tumorzellen ein erhöhtes Proliferationspotenzial (transient schnell replizierende Zellen), eine geringere Apoptoserate und eine weniger stark ausgeprägte Fähigkeit zur Differenzierung (geringere Differenzierungsstufe)

Full size image
Tab. 1 Primäre und sekundäre Charakteristika von Tumorstammzellen
Full size table

Der Prozess der Metastasierung und die Struktur der Metastasen unterscheiden sich nach beiden Hypothesen und sind in Abb. 4 c, d gegenübergestellt. Beide Modelle sind stark vereinfachend und können die wirkliche Komplexität eines Tumors nur annähernd abbilden. Epigenetische Modifikationen in der Genexpression mit Veränderungen des zellulären Phänotyps und die Mikroumgebung des Tumors bleiben ebenso wie Veränderungen des Tumors über die Zeit (subklonale genetische Diversität, Tumorvolumen, Gefäßversorgung, Hypoxie, Nekrosen) unberücksichtigt. Insbesondere der Mikroumgebung der CSC, der sogenannten Stammzellnische, bestehend aus supportiven Zellen (Fibrozyten, immunkompetente Zellen, Perizyten, Endothelzellen…) und extrazellulärer Matrix, wird eine große Bedeutung bei der malignen Progression zugeschrieben.

Methoden der Identifizierung und Anreicherung von Tumorstammzellen

Zellsortierung

Die in der Praxis am häufigsten verwendeten In-vitro-Verfahren zur Identifizierung und Anreicherung von CSC sind die fluoreszenzmarkierte und/oder magnetische Zellsortierung, bei denen spezifische Antikörper gegen einen oder mehrere (Oberflächen-)Marker von Stammzellen verwendet werden (Tab. 2, Abb. 6). Hier wird sichtbar, dass es keinen universellen Tumorstammzellmarker gibt, auch wenn beispielsweise CD133 mit mehreren Tumorentitäten assoziiert ist. Bei bestimmten Tumorentitäten gibt es sogar differente Ergebnisse. Beim kolorektalen Karzinom wurden durch eine Arbeitsgruppe CD133 exprimierende Zellen als CSC identifiziert [28], andere zeigten jedoch, dass CSC EpCAMhigh/CD44+ exprimieren und nicht CD133 [12]. Bei Ovarialkarzinom-CSC sind besonders folgende Marker relevant: CD44, CD117, CD133 und ALDH [24, 36, 37]. Erste immunhistochemische Untersuchungen mit den Stammzellmarkern CD133 und Nestin konnten an einem größeren Patientenkollektiv mit fortgeschrittenem serösem Ovarialkarzinom (n = 123) eine verstärkte Cisplatinresistenz sowie ein verkürztes Gesamtüberleben bei einer Überexpression von Nestin nachweisen [31]. In einer anderen Studie mit Immunfluoreszenz an Gewebemikroarrays (TMAs) von 56 Patientinnen mit einem Ovarialkarzinom zeigten sich ein schlechteres progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben, wenn die Tumorzellen ALDH+/CD133+ waren [37]. Leider steht hinter diesen und vergleichbaren Ergebnissen [46] beim Ovarialkarzinom noch keine unmittelbare klinische Konsequenz, aber sie unterstreichen die klinische Bedeutung von CSC-Markern für die Prognoseeinschätzung.

Tab. 2 Übersicht spezifischer CSC-Marker sowie Anteil der CSC an der Gesamtzellpopulation bei verschiedenen Tumorentitäten. (Mod. nach [17, 32, 35])
Full size table
Abb. 6
figure 6

FACS („fluorescence-activated cell sorting“). Fluoreszenzzellsortierung von Tumorstammzellen einer primären Ovarialkarzinomzelllinie. CSC: CD44-PE+/CD24-FITC−-Zellen (tumorigene CSC-Fraktion). Resi: CD44-PE+/CD24-FITC+-Zellen (nichttumorigene Residualzellfraktion). PE Phycoerythrin, FITC Fluoresceinisothiocyanat

Full size image

Der Anteil der CSC an der Gesamtzahl von Tumorzellen differiert stark und ist abhängig von der Selektionsmethode und dem Stadium der Tumorprogression. Es werden Anteile von 0,0001 % [17] bis 41 % beschrieben [9]. Bareiss et al. [7] zeigten, dass die Expression des Transkriptionsfaktors SOX2 bei Zellen des serösen Ovarialkarzinoms die Expression von CSC-Markern erhöht.

Tumorsphären

CSC können auch durch ihre Eigenschaft identifiziert werden, dass sie bei Kultivierung im serumfreikonditionierten Medium, das mit bestimmten Wachstumsfaktoren versetzt ist, in sogenannten Sphären wachsen. Diese Tumorsphären enthalten jedoch neben den CSC auch Progenitorzellen und noch weiter differenzierte, nichttumorigene Zellen [22], weshalb die aus den Sphären gewonnen Zellen auch als „stem-like cells“ bezeichnet werden.

Teilungsverhalten

Eine weitere Möglichkeit ist ein vom Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie in Leipzig patentiertes Verfahren, das auf dem unterschiedlichen Teilungsverhalten der Tumorsubpopulationen basiert [34]. Im Vergleich zu den nichttumorigenen Tumorzellen, die sich schnell teilen und damit die Haupttumorlast bilden, teilen sich die CSC nur sehr langsam. Es wird ein retrovirales Vektorsystem genutzt, um eine GFP-Insertion (grün fluoreszierendes Protein) in Tumorzellen einzubringen. Hierzu muss dieser Marker zunächst über Plasmide in Vehikelzellen (Phoenixzellen) transfiziert werden. Anschließend erfolgt eine Transduktion der dadurch hergestellten retroviralen Partikel in alle sich schnell teilenden Zellen. Diese fluoreszieren grün und können so in einer FACS-Analyse („fluorescence-activated cell sorting“) von den sich in der G0-Phase befindlichen CSC separiert werden. So ist es möglich, unabhängig von Surrogat-Zelloberflächen-Antigenen eine Negativselektion von CSC vorzunehmen. Damit wird ein höherer Reinheitsgrad der separierten CSC im Vergleich zu auf Oberflächenantigenen basierenden Verfahren erreicht, da partiell auch auf den nichttumorigenen Zellen sowie auf somatischen Zellen stammzellassoziierte Antigene exprimiert werden.

Xenotransplantation/serielle Transplantationen

Der kritischste Punkt bei den Anreicherungsverfahren liegt im Beweis der Fähigkeit der Zellen, an sekundärer Stelle erneut einen Tumor zu bilden. Der „Goldstandard“ hierfür ist die Xenotransplantation auf immundefiziente Mäuse. Zum Nachweis des Selbsterneuerungspotenzials und gleichfalls zu ihrer Anreicherung können auch serielle Transplantationen genutzt werden [8].

In-vivo-Monitoring

Neben den Methoden zur Identifizierung und Anreicherung sowie Bestätigung durch Xenotransplantation gibt es ein sehr interessantes Verfahren für ein In-vivo-Monitoring der CSC im Gewebe, die genetische Zelllinienverfolgung („cell lineage tracing“). Hierbei kann bei transgenen Mäusen über eine klonale Analyse mit einem Reporter-Gen eine Aussage über das Potenzial zur Proliferation, Heterogenität, Selbsterneuerung und Differenzierung von CSC erreicht werden [8]. Im Wesentlichen geht es um die Frage, wie eine bestimmte Zelle in ihrer natürlichen Umgebung den Grad ihrer terminalen Differenzierung, der das Schicksal dieser Zelle bestimmt, erlangt. In der Entwicklungsbiologie ist das „fate mapping“ (Schicksalsbestimmung) ein Verfahren zum Verständnis des embryonalen Ursprungs verschiedener Gewebe im erwachsenen Organismus. Dabei wird die Korrespondenz zwischen den einzelnen Zellen (oder Zellgruppen) eines Entwicklungsstadiums und deren Nachkommen in einem späteren Stadium der Entwicklung bestimmt. Wenn dies auf Einzelzellniveau erfolgt, wird diese Prozedur als „cell lineage tracing“ (Zelllinienverfolgung) bezeichnet und wurde bisher mit onkologischer Fragestellung an Haut- und Darmtumoren sowie dem Mammakarzinom durchgeführt. Kürzlich haben Wissenschaftler weitere Ansätze entwickelt, die auf Grundlage von fluoreszierenden Peptidtracern sowie der GFP-Reporter-Gen-Technologie erfolgen [8].

Chemotherapieresistenz und neue Therapieoptionen

Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre sprechen dafür, dass die Rezidiventstehung bei Leukämien und auch bei soliden Tumoren damit zusammenhängt, dass traditionelle Chemo- und Radiotherapien die CSC nur wenig oder gar nicht beeinflussen [26]. Bei der Therapie des Ovarialkarzinoms reduzieren platinhaltige Chemotherapien sehr erfolgreich die Tumormasse. Überlebende CSC können jedoch Ausgangspunkt eines Rezidives sein (Abb. 4 e, f). Zum Beispiel zeigten Wang et al. [44] an multizellulären Tumorsphäroiden eines Ovarialkarzinoms, dass diese Zellen im Vergleich zur Gesamtheit der Tumorzelllinie (OVCAR-3) wesentlich weniger auf die traditionellen Chemotherapeutika Cisplatin, Topotecan und Docetaxel ansprachen. Es wurden mehrere Mechanismen zur Resistenzentwicklung von CSC beschrieben. Bei CSC des Ovarialkarzinoms wird vermutet, dass sie die präexistenten DNA-Reparatursysteme normaler Stammzellen übernehmen und Membran-ATPasen exprimieren [17]. Zudem sind ovarielle CSC resistent gegenüber der Tumornekrosefaktor-α-induzierten Apoptose [3] und bilden ein Tumormikromilieu, das beispielsweise durch die Ausbildung von Thermotoleranz zu einer Resistenzbildung beiträgt. Insgesamt können wahrscheinlich die CSC einen DNA-Schaden schneller reparieren und exprimieren höhere Level an antiapoptotischen Molekülen [8].

Die Identifizierung und die Anreicherung von CSC eröffnen die Möglichkeit, zielgerichtete Therapien zur selektiven Beeinflussung von CSC zu finden, ohne die somatischen Stammzellen zu schädigen. Zum einen wurde in einem allgemeinen Ansatz versucht, Wirkstoffbibliotheken auf stammzellwirksame Substanzen zu screenen [27]. Zum anderen wurden Moleküle analysiert, die inhibitorisch auf Signalwege wirken, die speziell in CSC dereguliert sind (z. B. Hedgehog, Notch, PTEN/AKT und Wnt-/β-Catenin-Signalwege). Dieser Ansatz hat zur Identifizierung mehrerer potenzieller therapeutischer Wirkstoffe geführt, die derzeitig in Studien getestet werden. Die Firma OncoMed Pharmaceuticals hat beispielsweise im September 2013 erklärt, dass sie eine klinische Studie Phase Ib/II mit ihrem Antitumorstammzellmedikament Demcizumab, einem humanisierten monoklonalen Antikörper gegen den Delta-Like Ligand 4 (DLL4) im Notchsignalweg, begonnen hat. Dieses Medikament ist als Kombinationstherapie bereits beim fortgeschrittenen Pankreas- und nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom in Phase-Ib-Studien getestet worden. Nun wird es in Kombination mit Paclitaxel beim platinresistenten Ovarialkarzinom untersucht. Weitere Substanzen sind in der präklinischen Testung [1].

Eine weitere vielversprechende Therapiemöglichkeit entsteht durch die Verwendung von CSC in der Immuntherapie; es gibt bereits Studien zur therapeutischen Nutzung dendritischer Zellen, die mit CSC beladen werden [29, 45].

Zudem wird die Nutzung von Gewebestammzellen, insbesondere den aus der Plazenta stammenden mesenchymalen Stammzellen, als Vektoren für therapeutische Trans-Gene auf Tumorzellen erforscht. Erste Studien beim Ovarialkarzinom liegen vor, in denen zelltodinduzierende und proliferationshemmende Gene übertragen wurden [25].

Status quo und Perspektiven

In den letzten Jahrzehnten haben sich Untersuchungen an Stammzellen zu einem eigenständigen Forschungsgebiet in der Medizin entwickelt. Neben den embryonalen und adulten (Gewebe-)Stammzellen als zentralem Element in der Regenerationsmedizin haben die CSC der onkologischen Forschung eine neue Ausrichtung gegeben. Das Tumorstammzellmodell hat sich zur Darstellung der Tumorinitiierung und der malignen Progression, einschließlich der Mechanismen der Metastasierung und Rezidiventstehung, etabliert und spiegelt insbesondere beim Ovarialkarzinom den klinischen Krankheitsverlauf mit einer oft guten Chemotherapiesensitivität in der ersten Erkrankungsphase und zunehmender Chemotherapieresistenz im weiteren Verlauf theoretisch gut wieder. Ob die CSC wirklich für den klinischen Verlauf unserer Patientinnen verantwortlich sind, bleibt allerdings vorerst noch offen.

Zunächst ist es aus unserer Sicht essenziell, die Methoden zur Identifizierung einzelner CSC zu optimieren und zu standardisieren, da die bisher verwendeten (Oberflächen-)Marker nicht spezifisch genug sind. Dies ist die Grundlage für eine zielgerichtete CSC-orientierte Diagnostik am Primärtumor oder auch in entfernteren Kompartimenten (Knochenmark, Blut) und damit der erste Schritt für eine CSC-basierte Prognosebeurteilung und auch eine personalisierte, auf CSC ausgerichtete Krebsmedizin. Die Methoden der Separation einer größeren Anzahl von CSC und deren Kultivierung müssen ebenfalls verbessert werden, da nach unserer Erfahrung gegenwärtig nur in ca. 20 % die Etablierung einer Tumorstammzelllinie aus einem Primärtumor gelingt. Dies ist aber die Voraussetzung für die präklinische Testung neuer Substanzen und auch für individuelle prätherapeutische In-vitro-Untersuchungen. Darüber hinaus wäre eine vergleichende Analyse von CSC-Isolierungen zum gleichen Zeitpunkt, aber an verschiedenen Tumorlokalisationen (Primärtumor und Metastase) sowie sequenziell in der Primär- und Rezidivsituation wünschenswert, um die sogenannte zelluläre Plastizität des Systems mit Änderung der zellulären Hierarchie, einschließlich des Einflusses einer Systemtherapie, besser zu verstehen [41].

Im letzten Jahrzehnt haben genomweite Sequenzierungsanalysen verschiedener Tumorentitäten zu bahnbrechenden Erkenntnissen der Karzinogenese geführt und eine Gruppe von entscheidenden Treibermutationen identifiziert [43]. Die Rolle der CSC und ihre Unterschiede zu den nichttumorigenen Zellen müssen in diesem Kontext noch weiter spezifiziert werden.

Bei den therapeutischen Ansätzen steht nicht nur die Induktion des Zelltodes der CSC (wie in Abb. 4 dargestellt) im Vordergrund, sondern auch die Beeinflussung des Selbsterneuerungspotenzials und der spezifischen Mikroumgebung, der Stammzellnische. So werden beispielsweise Wege gesucht, um die CSC in eine Differenzierung zu drängen. Eine allein gegen die CSC gerichtete Therapie wird aufgrund der Plastizität der CSC-Nachkommen nicht ausreichend sein, um den gesamten Tumor zu erfassen [41], sodass wahrscheinlich eine Kombination mit klassischen Chemotherapeutika angestrebt werden muss. Wir sind uns sicher, dass sich die klinische Bedeutung der CSC in Zukunft enorm steigern wird.

Fazit für die Praxis

  • Das Tumorstammzellmodell liefert eine Erklärung für klinische Charakteristika des Krankheitsverlaufs beim Ovarialkarzinom wie die Entwicklung von Chemotherapieresistenzen und die hohe Rezidivrate.

  • Ovarialkarzinome haben ihren Ursprung im Müller-Epithel und seltener auch im ovariellen Oberflächenepithel. Bei der Tumorinitiierung sind Gewebestammzellen beteiligt.

  • Die Identifizierung von Tumorstammzellen (CSC) ist dadurch erschwert, dass bisher noch keine ausreichend spezifischen Oberflächenmarker gefunden wurden.

  • Eine optimierte Identifizierung und Anreicherung von CSC bildet die Grundlage für die Entwicklung zielgerichteter Therapien zur selektiven Beeinflussung von CSC ohne Schädigung der somatischen Stammzellen.

  • Therapeutische Ansätze finden sich in der Induktion des Zelltodes der CSC, der Beeinflussung des Selbsterneuerungspotenzials und der Stammzellnische.