Vierzig Jahre lang war die konventionelle Chromosomenanalyse der Goldstandard in der Pränataldiagnostik. Mit Einführung der Bänderungstechniken wurde es nicht nur möglich, Veränderungen in der Kopienzahl der Chromosomen zu erkennen (Aneuploidien), sondern auch balancierte und unbalancierte Translokationen sowie Deletionen und Duplikationen im mikroskopisch nachweisbaren Bereich. Hauptindikation für die Pränataldiagnostik blieb über mehr als 30 Jahre ein erhöhtes Alter der Schwangeren. Die Fortschritte in der Ultraschalldiagnostik haben jedoch das demographische Profil der Frauen, die Pränataldiagnostik in Anspruch nehmen, und damit die Anforderungen an die Diagnostik erheblich verändert. Die Einführung der hochauflösenden Ultraschalldiagnostik machte pränatal die Einführung einer hochauflösenden molekularen Karyotypisierung notwendig. Ebenso wie in der postnatalen Diagnostik die hochauflösende Array-Technik zur Erkennung neuer syndromaler Erkrankungen führte, ist jetzt auch pränatal eine Differenzierung von Krankheitsbildern möglich, die bisher einer Diagnostik nicht zugänglich waren.

Array-Diagnostik

Vorteile und Grenzen pränatal

Die „array comparative genomic hybridization“ (Array-CGH) erkennt mit hoher Sicherheit alle (unbalancierten) Veränderungen in der Kopienzahl, die mit der konventionellen Chromosomenanalyse erkannt werden. Sie hat dabei das Potenzial, Kopienzahlveränderungen auch im Bereich weit unterhalb des Auflösungsbereichs gebänderter Chromosomen zu erkennen (durchschnittliche Auflösung der konventionellen Chromosomenanalyse: etwa 5 Mb im Vergleich z. B. mit dem pränatal zum Einsatz gekommenen 105-K-Oligo-Array der Fa. Agilent (Auflösung etwa 30 Kb), daraus ergibt sich eine etwa 150-fach höhere Auflösung). Anders als die konventionelle Chromosomenanalyse verlangt die Array-CGH keine vorherige Zellkultur. In Fällen, in denen für eine Zellkultur nur eine unzureichende Menge fetaler Zellen zur Verfügung steht, können DNA-Mengen im Nanogrammbereich durch eine „whole genome amplification“ (WGA) ohne nachweisbaren Bias für eine Array-CGH genutzt werden [2].

Seit über 10 Jahren steht die Array-CGH-Technologie zur Verfügung [8, 11]. Trotz der genannten Vorteile hat sie sich nur schwer in der Pränataldiagnostik etablieren können. Gegenüber der konventionellen Karyotypisierung bestehen unbestreitbar höhere Investitions- und Verbrauchskosten. Daneben besteht eine kontrovers geführte Diskussion darüber, ob in der Pränataldiagnostik eine Technologie eingesetzt werden darf, bei der mit einiger Wahrscheinlichkeit Kopienzahlvarianten („copy number variations“, CNVs) detektiert werden, deren Bedeutung, ob benigne oder pathologische Kopienanzahlvariante, häufig unklar sei. Ebenso wird kritisiert, dass bei der Untersuchung sicher pathologische CNVs detektiert werden können, die nicht im Zusammenhang mit der eigentlichen Fragestellung stünden (Übersicht bei [7]). Auch wurde argumentiert, dass das Ergebnis der molekularen Karyotypisierung in den meisten Fällen keine prognostische Einschätzung zulasse [3, 9]. Letzteres Argument könnte zutreffen, wenn routinemäßig ein hochauflösender Oligo- oder Single-nucleotide-polymorphism(SNP)-Array als First-tier-Test in einer Niedrigrisikogruppe, wie z. B. Altersrisiko bei unauffälligem Ultraschallbefund, eingesetzt würde. Wie jede andere Technologie sollte die Array-CGH in der Pränataldiagnostik nur nach klaren Indikationskriterien unter Berücksichtigung von Verhältnismäßigkeit und Wirtschaftlichkeit sowie Festlegung der Standards für die Auswertung und Befundinterpretation durchgeführt werden ([1, 6], Tab. 1).

Tab. 1 Voraussetzungen zur Durchführung einer Array-CGH in der Pränataldiagnostik
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Indikationen

Die Array-CGH-Technologie wird heute in der Präimplantationsdiagnostik nach Trophoektodermbiopsie und in der Pränataldiagnostik im 1. Trimenon in Chorionzottenzellen sowie im 2. und 3. Trimenon in Fruchtwasserzellen und fetalen Blutzellen eingesetzt. Aufgrund der Heterogenität der zu untersuchenden Gewebe und wegen der unterschiedlichen Fragestellungen kommen verschiedene Array-Plattformen zur Anwendung. Wie bei den einzelnen Indikationsgruppen detailliert ausgeführt, sind wir der Ansicht, dass eine Array-CGH pränatal nicht als First-tier-Testung durchgeführt werden sollte. Zur schnellen molekularen Diagnostik der häufigsten Chromosomenaberrationen hat sich als First-tier-Diagnostik der sog. Schnelltest etabliert, welcher mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs(FISH)-, Quantitative-fluorescence-polymerase-chain-reaction(QF-PCR)- oder Multiplex-ligation-dependent-probe-amplification(MLPA)-Technik durchgeführt wird. Die QF-PCR als rasche und außerordentlich kostengünstige Technik [10] erlaubt gleichzeitig auch eine Aussage hinsichtlich einer maternalen Kontamination der fetalen Zellen.

Im 2. und 3. Trimenon

Die Array-CGH wird in der Pränataldiagnostik mit Abstand am häufigsten bei Untersuchungen im 2. und 3. Trimenon eingesetzt. Ein Problem der pränatalen Ultraschalldiagnostik ist, dass viele fetale Auffälligkeiten erst zum Ende des 2. Trimenon, gelegentlich auch erst später erkannt werden bzw. erkannt werden können. So lässt sich die Mehrheit der intrauterinen Wachstumsretardierungen erst nach der 20. Schwangerschaftswoche (SSW) nachweisen und ebenso dabei assoziiert vorkommende strukturelle, im Ultraschall nachweisbare Auffälligkeiten, wie eine Mikrozephalie und ein großer Teil aller Herzfehler oder Hand- und Fußstellungsanomalien. So betrug im eigenen Patientenkollektiv bei über 4000 konsekutiven Fruchtwasserproben (2009–2010) der Anteil der Proben > 18. SSW bei der Indikation „eine oder mehrere nachgewiesene Fehlbildungen“ 60% und bei der Indikation „intrauterine Wachstumsretardierung“ („intrauterine growth retardation“, IUGR)“ mit oder ohne assoziierte Fehlbildung 95%. Ein spezielles Problem ist dabei, dass in diesen Fällen häufig nicht die klassischen Trisomien vorliegen, die sich mithilfe der QF-PCR oder einer anderen Schnelltestmethode nachweisen lassen, sondern Strukturaberrationen, die unterhalb des Auflösungsvermögens des Mikroskops liegen oder numerische Aberrationen im Mosaikstatus. Im genannten Patientenkollektiv ließen sich bei der Indikationsstellung „auffälliges Ersttrimesterscreening“ („first trimester screening“, FTS) 85% aller detektierten Chromosomenaberration mithilfe der QF-PCR nachweisen, in den Hochrisikogruppen hingegen sank der Anteil auf 60%. Vor allem bei fortgeschrittener Schwangerschaft ist der Wunsch der Schwangeren nach rascher Abklärung nicht nur nachvollziehbar, sondern eine umfassende und schnelle Diagnostik, wie sie die Array-CGH ermöglicht, ist objektiv aus juristischen und ethischen Gesichtspunkten zu begründen. So sollte z. B. eine abschließende Diagnostik bis zum Ende der 20. SSW wegen der danach bestehenden potenziellen Lebensfähigkeit des Fetus vorliegen. Die Tab. 2 zeigt den Anteil der einzelnen Indikationsgruppen an der Zahl aller Fruchtwasserproben, den jeweiligen Anteil an Spätamniozentesen und die jeweilige Häufigkeit der Chromosomenaberrationen in 4626 konsekutiven Fruchtwasserproben.

Tab. 2 Anteil der Fruchtwasserproben nach Indikation, ≥ 18. SSW und Aberrationsraten (%) in kultivierten Fruchtwasserzellen nach konventioneller Karyotypisierung (N = 4626)
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Das „Altersrisiko“ stellt in unserem Einsenderlabor mit etwa 72% immer noch die häufigste Indikation dar. Der Anteil an detektierten Chromosomenaberrationen nach konventioneller Karyotypisierung in dieser Indikationsgruppe entsprach mit 2,4% der erwarteten Aberrationsrate. 60% aller Aberrationen in dieser Gruppe wurden mithilfe der QF-PCR detektiert. Von der Anwendung der Array-CGH bei den nach QF-PCR unauffälligen Proben hätte lediglich 1% dieser Patientinnen in dieser Indikationsgruppe im Sinne einer schnelleren Diagnosestellung profitiert. Unter Abwägung der Kosten, des Aufwands und der Möglichkeit der Entdeckung von CNVs mit unklarer Bedeutung erscheint es nicht gerechtfertigt, in einem so großen Patientenkollektiv eine Array-CGH als First-tier-Diagnostik durchzuführen. Für die Indikationsgruppe „erhöhtes Risiko nach Ersttrimesterscreening“ und die Indikationsgruppe „2 oder mehr Softmarker im Ultraschall“ gilt dies entsprechend, da hier 85% aller unbalancierter Karyotypen mithilfe der QF-PCR detektiert werden.

Ergibt sich aufgrund des Ultraschallbefundes und/oder der anamnestischen Daten (Infobox „Fallbeschreibung“, Abb. 1) eine hohe Wahrscheinlichkeit für einen unbalancierten Chromosomenbefund, erscheint es bei fortgeschrittener Schwangerschaftsdauer (≥ 18. SSW) gerechtfertigt, nach Vorliegen eines unauffälligen QF-PCR-Befundes nicht erst das Ergebnis der konventionellen Karyotypisierung abzuwarten, sondern dann unmittelbar eine Array-CGH durchzuführen. Da auch bei den Indikationsgruppen „auffälliger Ultraschallbefund in mehreren Organen“ und „intrauterine Wachstumsretardierung mit oder ohne assoziierte Fehlbildungen“ in etwa 60% ein positiver QF-PCR-Befund zu erwarten ist, handelt es sich um eine vertretbar geringe Anzahl an Untersuchungen. Beschränkt man die Array-Untersuchung auf die Fruchtwasserproben jenseits der 18. SSW, betrifft das etwa 2–3% aller Fruchtwasserproben. Der potenzielle Nachteil einer Entdeckung von CNVs mit unklarer Bedeutung wird unseres Erachtens in dieser Situation bei Weitem aufgewogen durch die Vorteile, unbalancierte Chromosomenaberrationen mit hoher Sicherheit auch im submikroskopischen Bereich zu erkennen, ohne eine Zellkultur durchführen zu müssen. Um Unsicherheiten in pränatalen Fällen zu vermeiden, sollte jedes Labor, das pränatal eine Array-CGH einsetzt, nicht nur klare Kriterien für die Indikation zur Durchführung dieser Untersuchung, sondern v. a. klare Vorgaben hinsichtlich der Mindestgröße der Kopienzahlveränderungen haben (in Abhängigkeit von der benutzten Plattform, [3]), die bewertet werden und hinsichtlich der genomischen Regionen, die als klinisch signifikant gelten (Tab. 1). In pränatalen Fällen „targeted arrays“, die ausschließlich bekannte Mikroaberrationsregionen umfassen, zu benutzen, um damit die Wahrscheinlichkeit für die Detektion unklarer CNVs zu minimieren, halten wir für problematisch, da damit auch klinisch wichtige Aberrationen evtl. nicht detektiert werden.

 

 

Abb. 1
figure 1

Array-CGH (Fa. Agilent, 105-K-Chip). Etwa 7,3-Mb-Deletion Xp22.2p22.32, die u. a. die Gene HCCS, AMELX, KAL1 und NLGN4X einschließt. a Schematische Übersicht des X-Chromosoms, gestrichelt umrandet deletierte Region Xp22.2p22.32. b Vergrößerte Darstellung des deletierten Bereichs, grüne Punkte Array-Sonden, die eine Deletion anzeigen (Erläuterung s. Infobox „Fallbeschreibung“)

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Eine weitere wichtige Rolle kommt der Array-CGH als weiterführende Diagnostik nach Detektion von numerischen oder strukturellen Aberrationen nach konventioneller Karyotypisierung zu. Die exakte Bruchpunktbestimmung ist bei der Abschätzung des Risikos bei unbalancierten Strukturaberrationen sehr hilfreich, ebenso auch bei der Abschätzung von relevanten kodierenden Sequenzen bei Markerchromosomen und zum Ausschluss von Deletionen oder Duplikationen im submikroskopischen Bereich nach konventioneller Karyotypisierung und offenbar balancierter Chromosomenstrukturaberration. Wird eine Array-CGH nach Detektion von Mosaikbefunden in unkultivierten Zellen durchgeführt, gelingt mit ihr eine wesentlich bessere Abschätzung des prozentualen Anteils an Zellen mit unbalanciertem Karyotyp als nach konventioneller Diagnostik nach Zellkultur [5]. Dies kann v. a. bei der Differenzierung zwischen echtem fetalen Mosaikstatus und Pseudomosaik hilfreich sein.

Nach der Einführung der Array-CGH in die Laborroutine Ende 2008 wurden in unserem Labor nach den genannten Kriterien bis Ende 2011 bei über 7000 Fruchtwasserproben insgesamt 202 Array-CGH-Untersuchungen durchgeführt. Dies entspricht einem Anteil von 2,8% aller Fruchtwasserproben, 16% dieser Array-Analysen erfolgten nach Detektion eines Markerchromosoms, bei Translokationen de novo, zur Bruchpunktbestimmung bei unbalancierten Befunden oder bei unklaren strukturellen Befunden nach konventioneller Karyotypisierung.

In 8,9% dieser Array-Untersuchungen wurde ein gesicherter pathologischer Befund nach unauffälligem Befund in der konventionellen Karyotypisierung erhoben. In 2 Fällen (0,9% aller Untersuchungen) ergab sich ein sicher pathologischer Befund, der nicht mit der Fragestellung in Zusammenhang stand und welcher als ein gesonderter Punkt in der Beratung der Eltern unter Berücksichtigung der Einwilligung zur Untersuchung nach Gendiagnostikgesetz (GenDG) besprochen wurde.

Nach Chorionzottenbiopsie im 1. Trimenon

Indikationen für die Durchführung einer Chorionzottenbiopsie (CVS) im 1. Trimenon sind mehrheitlich ein Altersrisiko bei auffälligem Ersttrimesterscreening oder isolierte Ultraschallbefunde, die auf ein erhöhtes Risiko für eine Chromosomenaberration hinweisen – wie eine verbreiterte Nackentransparenz, ein Hygroma colli, Hydrops fetalis oder spezielle Herzfehler wie Atrioventrikular(AV)-Kanal. Die retrospektive Analyse von über 600 konsekutiven CVS ergab eine Chromosomaberrationsrate von 10% mit einem deutlich höheren Anteil pathologischer Befunde bei extrem verbreiterter Nackentransparenz/Hygroma colli (etwa 50%). Der Anteil an den klassischen Chromosomenaberrationen wie 45,X-Status und Trisomien der Chromosomen 13,18 und 21 am Gesamtanteil aller pathologischen Karyotypen betrug 85%. Von einer hochauflösenden Array-CGH hätten zusätzlich 0,9% der Schwangeren in dieser Gruppe profitiert. Nach der S2-Leitlinie sollen nach CVS sowohl eine Analyse nach Direktpräparation bzw. Kurzzeitkultur als auch nach einer Langzeitkultur erfolgen. In vielen Laboratorien wird die Kurzzeitkultur durch einen Schnelltest mithilfe der QF-PCR ersetzt. Entsprechend den vorherrschenden Indikationsgruppen im 2. und 3. Trimenon „Altersrisiko“ und „auffälliges Ersttrimesterscreening“ erscheint auch bei der CVS der Einsatz der Array-CGH als First-tier-Diagnostik nicht gerechtfertigt. Wegen des relativ hohen Risikos eines gewebebegrenzten Mosaikbefundes in Chorionzottenzellen [4] ist hingegen zu diskutieren, ob als First-tier-Testung ein niedrig auflösender Array sinnvoll ist, der alle Chromosomen umfasst.

Eine Möglichkeit, wie die Array-CGH in die pränatale genetische Diagnostik eingebunden werden kann, wird in Abb. 2 schematisch dargestellt.

Abb. 2
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Ablauf der Pränataldiagnostik unter Einbeziehung der Array-CGH

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Präimplantationsdiagnostik

Nach der Entscheidung des Bundesgerichtshofs im Juli 2010 und dem Gesetzesbeschluss des Deutschen Bundestags vom 02.09.2011 zur Regelung der Präimplantationsdiagnostik (PID) wird eine Diagnostik zur Erkennung von Chromosomenaberrationen nach Trophoektodermbiopsie (Blastozystendiagnostik) zukünftig in einem begrenzten Ausmaß auch in Deutschland als früheste Form einer Pränataldiagnostik möglich sein.

Bei der Blastozystendiagnostik werden etwa am Tag 5 der außerkörperlichen Entwicklung Zellen bei einem nach In-vitro-Fertilisation entstandenen Embryo entnommen und genetisch untersucht. Anders als bei der bisher in Deutschland ausschließlich angewandten Polkörperdiagnostik können so auch vom Vater stammende Eigenschaften untersucht werden. Bei familiären Chromosomenaberrationen lässt sich durch die Anwendung spezieller Arrays mit hoher Sicherheit ausschließen, dass übertragene Embryonen einen unbalancierten Karyotyp aufweisen (Abb. 3). Zu berücksichtigen ist jedoch, dass nach Blastozystenbiopsie ein Teil der Embryonen wegen eines Mosaikstatus fälschlich als aneuploid diagnostiziert werden können. Wegen der geringen zur Verfügung stehenden DNA-Mengen wurden für das Untersuchungsverfahren Bacterial-artificial-chromosome(BAC)-basierte Arrays entwickelt, die sich in der Routine als robust erwiesen haben. Mit den derzeit zur Verfügung stehenden Plattformen ist das Risiko einer zufälligen und ungewollten Detektion von CNVs mit unklarer Bedeutung als sehr gering einzustufen.

Abb. 3
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Zeigt das Ergebnis zweier Bacterial-artificial-chromosome(BAC)-Arrays (24sure, BlueGnome) nach Trophoektodermbiopsie aufgrund einer paternalen Robertson-Translokation der Chromosomen 13 und 14. Nach zwei erfolglosen IVF-Zyklen kam es im 3. Zyklus nach Transfer eines Embryos mit balanciertem Chromosomenbefund zur fortlaufenden Schwangerschaft. Oben Trisomie 13, Monosomie 14; unten Trisomie 14, Monosomie 13

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Fazit für die Praxis

  • Die Array-CGH erkennt (ohne eine vorhergehende Anzüchtung fetaler Zellen) mit hoher Sicherheit Veränderungen in der Kopienzahl weit unterhalb des Auflösungsvermögens der konventionellen Chromosomenanalyse.

  • Wegen der Möglichkeit, bei der Diagnostik Kopienzahlveränderungen mit unklarer Bedeutung zu detektieren, hat sich die Array-CGH trotz dieser unstreitigen Vorteile nur schwer in der Pränataldiagnostik etablieren können.

  • Um Unsicherheiten zu minimieren, sollte die Array-CGH in der Pränataldiagnostik nicht als First-tier-Diagnostik, sondern nur ergänzend eingesetzt werden.

  • Ergibt sich aufgrund des Ultraschallbefundes und/oder der anamnestischen Daten eine hohe Wahrscheinlichkeit für einen unbalancierten Chromosomenbefund, erscheint es bei fortgeschrittener Schwangerschaftsdauer gerechtfertigt, nach Vorliegen eines unauffälligen Schnelltestbefundes unmittelbar eine Array-CGH durchzuführen.

  • Für die pränatale Array-Diagnostik sollten in jedem Labor in Abhängigkeit von der benutzten Array-Plattform klare Vorgaben hinsichtlich der Mindestgröße der Kopienzahlveränderungen, die bewertet, und der genomischen Regionen, die als klinisch relevant angesehen werden, bestehen.