In den letzten Jahren sind konkurrierende invasive und nichtinvasive Methoden auf dem Gebiet der klinischen und präklinischen Forschung implementiert worden, die sich mit der Quantifizierung von Gefäßparametern beschäftigen.

Zwischen der mikroskopischen Histomorphometrie auf der einen und der klinischen Angiographie auf der anderen Seite stehen sowohl dem Kliniker als auch dem Grundlagenforscher weitere Verfahren, wie z. B. die Positronenemissionstomographie (PET) [11, 12, 20], die Magnetresonanztomographie (MRT) [6, 7, 9], der intravaskuläre Ultraschall (IVUS) [31, 32] oder die Mehrzeilencomputertomographie (MSCT) [1, 2, 3, 28] zur Analyse pathologisch veränderter Gefäßstrukturen zur Verfügung.

Obwohl die quantitative Histomorphometrie oder stereologische Verfahren als der Goldstandard gelten, haben sie gewisse Nachteile. Nur wenige Mikrometer eines Gefäßes werden in diesen Verfahren zur Quantifizierung der Gefäßparameter (z. B. Gefäßwanddicke, Plaquegröße, Verkalkungen, Stenosegrad) herangezogen. Die Selektion des zu untersuchenden Segmentes ist mehr oder weniger zufällig, so dass Heterogenitäten stenosierender Läsionen kaum zuverlässig erfasst werden können. Durch Interpolierung wird auf die Dimensionen des gesamten Gefäßes oder eines bestimmten Gefäßsegmentes rückgeschlossen. Neben der zeit- und personalintensiven Probenaufbereitung bestehen die Nachteile einer 2-dimensionalen Gefäß- und Weichteildarstellung.

Als potenzielle Alternative zur quantitativen Histologie an Serienschnittpräparaten wurde im letzten Jahrzehnt die Technologie der µCT in der Ex-vivo-Forschung etabliert [4, 5, 13, 15, 16, 18, 19, 24, 25, 26, 29, 30]. So konnten mit diesem Verfahren in der vaskulären Grundlagenforschung reduzierte Gefäßvolumina von Vasa vasorum der Koronararterien bei experimenteller Hypercholesterinämie nachgewiesen werden [21]. Aber auch therapeutisch induzierte Regressionen atherosklerotischer Intimahyperplasien ließen sich mit dem Verfahren eindrucksvoll quantifizieren [33].

In diesem Artikel soll ein Überblick über die Grundlagen der µCT-Technologie und ihrer Anwendung in der quantitativ 3-dimensionalen Analytik von arteriellen, arteriolären und kapillären Gefäßparametern im kardiopulmonalen Gefäßsystem gegeben werden.

Grundlagen der Mikrocomputertomographie

Die wesentlichen technologischen Aspekte verschiedener µCT-Scanner wurden von Engelke et al. [8] ausführlich dargestellt. Zwischen einer Mikrofokusröntgenröhre und einem CCD- (Charge-couple-device-)Detektor ist in einem Scanner ein Probenschlitten auf einer drehbaren Achse befestigt. Dieser führt eine Rotationsbewegung in frei definierbaren Winkelschritten durch und kann entlang der Längsachse zwischen Röntgenröhre und Detektor bewegt werden. Im Gegensatz zu den in der klinischen Diagnostik am Patienten eingesetzten Computertomographen, dreht sich nicht die „gantry“ (Röntgenröhre und Detektor) um das Objekt, sondern das Objekt dreht sich in einem feststehenden Strahlengang. Die Abb. 1 zeigt den uns zur Verfügung stehenden Mikrotomographen (SkyScan1072_80 kV, Aartselaar, Belgien) und ein Schema der µCT-Technologie.

Abb. 1a, b
figure 1

Einblick in den Mikrocomputertomographen; der weiße Pfeil markiert eine einliegende humane Koronararterie, die zum Schutz vor Austrocknung luftdicht mit Parafilm® verpackt ist (a, bar=5 cm). Schematische Darstellung der µCT-Fächerstrahlengeometrie für Mikrofokusröhren mit Zeilendetektor (CCD-Kamera). Der Probenschlitten dreht sich in frei definierbaren Winkelschritten um die Röntgenröhre. Die CCD-Kamera misst die durch die Probe abgeschwächten Röntgenquanten und wandelt diese in ein digitales Signal um (b)

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Ein variabler Vergrößerungsmaßstab wird durch die Verschiebung des Objektes entlang der Längsachse erzielt. Die maximale Objektgröße beträgt bei diesem Tomographen 2,5×2,5×2,5 cm. Bei größeren Objekten können in der Bildberechnung Artefakte entstehen, da das Projektionsbild des Objektes nicht breiter als der CCD-Detektor sein darf.

Die theoretische Möglichkeit, ein kleines Objekt sehr dicht an die Strahlenquelle heranzuführen, um so einen möglichst hohen Vergrößerungsfaktor zu erzielen, ist technisch durch die Brennfleckgröße begrenzt. Auch eine Mikrofokusröhre hat einen Fokus von mehreren Mikrometern, so dass das Projektionsbild des Objektes auf dem CCD-Detektor bei zunehmender Annäherung des Objektes an die Strahlenquelle entsprechend unscharf wird.

Der Mikrotomograph arbeitet mit einer Fächerstrahlgeometrie. Die Fokusgröße der Strahlenquelle beträgt 8 µm. Die Röntgenröhre wird mit Beschleunigungsspannungen bis 80 kV bei einer Leistung von 8 W betrieben. Als Detektor dient eine ca. 25 µm dicke Szintillatorschicht, die auf dem Kamerafenster einer gekühlten CCD-Kamera mit 1.024×1.024 Pixeln aufliegt. Die maximale geometrische Vergrößerung, also das Verhältnis der Abstände von Strahlenquelle zu Detektor und von Strahlenquelle zu Objekt, beträgt ca. 80. Die Dauer des Scanvorgangs ist abhängig von der Objektgröße und der geometrischen Auflösung. Bei einem zylindrischen Gewebsstück mit einem Durchmesser von 1 cm ist mit einer Scanzeit von etwa 15 min auszugehen. Die Zeit, die für die dreidimensionale Bildrekonstruktion unter Verwendung des Feldkamp-Algorithmus [18] benötigt wird, beträgt bei Verwendung eines dualen Intel®Xeon™ Prozessors (2×1.800 MHz, 1.024 MB RAM) ca. 6 h.

Computermikrotomographien zur Evaluation von Weichgewebs-, Parenchym- und Gefäßstrukturen erfolgen bei einer Röhrenspannung von 60 kV, einer Stromstärke von 80 µA, einer Vorfilterung des Röhrenspektrums mit 3,0-mm-Aluminium und einer Belichtungszeit von 2,4 s/Rotationsschritt. In Rotationswinkelschritten von 0,45° werden Absorptionsbilder bei einer Akquisitionsmatrix von 1.024×1.024 Pixeln erzeugt, die mit Hilfe der Rückprojektionstechnik in isotrope, axiale Schnittbilder umgewandelt werden.

Mikrocomputertomographie in der Gefäß- und Weichteilquantifizierung

Ein erster Ansatz, die Gefäßarchitektur in 3-dimensionalen µCT-Datensätzen zu quantifizieren, wurde von Jorgensen et al. unternommen [15]. Sie konnten zeigen, dass in fixierten Koronararterien von Schweinen nach intravasaler Applikation von Kontrastmittel eine 3-dimensionale Darstellung der intramuralen Vasa vasorum bei einer Voxelgröße von 5–25 µm möglich ist. In weiterführenden Arbeiten von Wan et al. [30] konnte die dreidimensionale Gefäßarchitektur kontrastmittelperfundierter Rattenkoronararterien (Microfil MV-122, Flow Tech, Carver, MA, USA) und zahlreicher Koronararterienästen bis zu einem Durchmesser von 50 µm hoch aufgelöst quantitativ dargestellt werden.

Ausgehend von diesen Erkenntnissen war die Arbeitsgruppe um Lerman und Ritman [19, 26, 29] in der Lage, die µCT-Technologie in der systematischen Struktur-Funktions-Beziehung von isolierten, fixierten und perfundierten Organen einsetzen. Zur Evaluierung von Gefäßvolumina, Oberflächen- und Gefäßdichten wurden Vasa vasorum von Koronargefäßen [13, 14, 16, 26, 27, 29], Nierenarterien [30, 10], Leberarterien [29] und Pulmonalarterien [19] der Ratte mit dergleichen Technik untersucht. Durch die µCT konnte ein therapeutischer Effekt von Simvastatin auf die Gefäßdichte der Vasa privata von Koronargefäßen aufgezeigt werden [33].

Mikrocomputertomographiebefunde humaner Koronararterien

Atherosklerotische Veränderungen humaner Koronararterien lassen sich mit der µCT in hoher Auflösung ebenfalls quantitativ erfassen. Die 3-dimensionale Rekonstruktion einer humanen epikardialen Koronararterie ist in Abb. 2 dargestellt. Das zu untersuchende Gefäßsegment kann in allen 3 Raumrichtungen betrachtet, digital geschnitten sowie quantitativ analysiert werden. Auch die intramyokardialen Koronararterienäste sind der Quantifizierung zugänglich.

Abb. 2a–d
figure 2

Sagittale (a), koronare (b) und transversale (c) Darstellung einer humanen Koronararterie nach intraarterieller Perfusion mit Kontrastmittel. Die epikardiale Koronararterie lässt sich mit den nach intramyokardial abgehenden arteriellen und arteriolären Ästen darstellen. (d) „Multi intensity projection“ (MIP) mit der Möglichkeit zur volumetrischen Quantifizierung

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Zur elektronischen Beurteilung eines etwa 2 cm langen Segmentes menschlicher Koronararterien lassen sich bis zu 44.000 transversale µCT-Schnittbilder (Schichtdicke bis 8 µm) erstellen. Werden anschließend korrespondierende histologische Schnittpräparate von 2–3 mm langen Segmenten angefertigt und konventionell morphometrisch analysiert, ergibt sich zwischen den entsprechenden digitalisierten µCT-Segmenten und der Histomorphometrie eine hoch signifikante Korrelation (r≥0,98; p<0,001) hinsichtlich aller gemessener Plaquekriterien (Gefäßdurchmesser, Plaquegröße, Mediadicke, Lumendurchmesser, und Kalzifizierung; Abb. 3) [22].

Abb. 3a, b
figure 3

Korrespondierender, transversaler Schnitt durch eine humane Koronararterie in der µCT (a) und der Histologie (b). Verschiedene Gefäßparameter lassen sich in den beiden Methoden darstellen, Plaque (1), Differenzierung von Tunica media (2) zur Adventitia (3), Verkalkung (4) sowie das Lumen (6). Die Probe ist zum Schutz vor Austrocknung luftdicht verpackt (a, 5)

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Die lückenlose Gefäßdarstellung erlaubt kleinste intimale Strukturveränderungen, z. B. subendotheliale schaumzellreiche Atherombeete zu detektieren, die zunächst in der konventionell segmentalen histologischen Aufarbeitung ohne vollständige Aufarbeitung in Serienschnitten nicht erfasst worden wären (Abb. 4). In beiden Schnittebenen zeigt sich ein kleines subendotheliales Atherombeet. Die µCT ermöglicht eine exakte Lokalisation von Gefäßalterationen zur gezielten Gewebsentnahme für weiterführende histologische/immunhistologische Untersuchungen.

Abb 4a–d
figure 4

Sagittale Rekonstruktion einer humanen Koronararterie (a) in der µCT. Es zeigt sich eine kleine intimale Plaque (1), die ähnliche Dichtewerte aufweist wie die Adventitia (2). In den transversalen Schnitten lässt sich die Läsion ebenfalls erfassen (b) sowie in den Farbkodierungen ähnlichen Dichtewerten wie der Adventitia zuweisen (d). Immunhistologisch zeigen sich subendotheliale Akkumulationen von Fibrozyten und Schaumzellen (CD68+; PG-M1; c). Das Gefäß ist mit Plastikfolie umwickelt (b und d, weißer Stern)

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Durch die räumliche Darstellung über den Gefäßverlauf lassen sich verschiedene Plaquekomponenten quantitativ erfassen (Abb. 5). Die gleichzeitig durchführbaren Grauwertmessungen erlauben eine zuverlässige radiographische Kategorisierung der Läsionen in Atherome, Fibroatherome und kalzifizierte Läsionen (Abb. 6).

Abb. 5a–c
figure 5

Dreidimensionale Rekonstruktion einer humanen Koronararterie in der µCT. In allen Raumrichtungen kann das Gefäß betrachtet, geschnitten und analysiert werden (a). Exemplarisch an Verkalkungen lassen sich Plaquekomponenten volumetrisch erfassen (b1, c1). Um eine räumliche Orientierung der Plaquekomponenten zu erhalten, können gleichzeitig die transversalen Schnittbilder berechnet werden (b2, c2). Dabei können die Verkalkungen jeweils quantitativ im transversalen Schnittbild planimetrisch erfasst werden (b2)

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Abb 6a–d
figure 6

Konventionelle Angiographie zur Darstellung des Stents in der infrarenalen Bauchaorta eines Kaninchens (a). Die Stentstreben sind in der angiographischen Kontrolle lediglich schemenhaft darstellbar (a, weißer Pfeil). In der Übersichtsaufnahme in der µCT lassen sich Stent und Stentstreben sehr gut erkennen (weißer Pfeil, b). Histologisch besteht eine deutliche Intimahyperplasie (c, blauer Pfeil; die Stentstreben wurden vor der Schnittherstellung entfernt, schwarzer Pfeil). In der µCT (d) lässt sich die Intimahyperplasie (d, blauer Pfeil) luminal der Stentstreben (d, schwarzer Pfeil) quantitativ erfassen

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Stentbedingte Restenosen in der Aorta

Die Quantifizierung der Restenose nach Ballonangioplastie und Stentimplantation ist ein ebenfalls zeit-, personal- und laborintensives Verfahren und erfolgt in der Regel histomorphometrisch an Serien- oder Stufenschnitten. Die gewonnenen quantitativen Daten werden dabei auf das gesamte Gefäßsegment interpoliert.

Im Tiermodell kann nach Endotheldenudierung mit konsekutiver Stentimplantation (Abb. 6a) eine reproduzierbare Intimahyperplasie erreicht werden. In der µCT lassen sich an den explantierten Aortensegmenten die Stentstreben von der umgebenden Gefäßwand und der verbreiterten Intima differenzieren (Abb. 6b). Die morphometrische Analyse zeigt eine deutliche Intimahyperplasie (Abb. 6d), die mit korrespondierenden histologischen Schnitten verglichen wurde (Abb. 6c). Auch hier bestanden hohe Korrelationen im quantitativen Vergleich beider Methoden. Der Vorteil der nichtdestruktiven Analytik mit der µCT ergibt sich aus der gezielten Detektion morphologischer Veränderungen, bevor einzelne Stentsegmente der histopathologischen Untersuchung zugeführt werden, sowie der Möglichkeit zur quantitativen Bestimmung von Gefäßparametern vor der Einbettung des Gewebes.

Intrapulmonale Gefäße und Alveolarsepten

Grundvoraussetzung zur Volumetrie des pulmonalen Gefäßsystems ist eine homogene und vollständige Perfusion der Pulmonalgefäße durch Kontrastmittel (Abb. 7).

Abb 7
figure 7

Dreidimensionale „multi intensity projection“ (MIP) einer Rattenlunge nach intravenöser In-vivo-Perfusion mit Kontrastmittel in der µCT. Die Pulmonalarterien sind nahezu lückenlos mit Kontrastmittel perfundiert

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Zur Perfusion von Kontrastmittel wird spontan atmenden, jedoch final narkotisierten Tieren ein Kontrastmittelgemisch, bestehend aus Barium und Gelatine, über einen zentralvenösen Katheter (V. jugularis interna) appliziert. Nach Abkühlung der Tiere sind die Lungen durch die ausgehärtete Gelatine stabilisiert und frei entfaltet. Durch diese Methode konnten wir erstmals eine gleichzeitige quantitative volumetrische Analyse des Lungengerüstes, der Alveolen und der intrapulmonalen Gefäße durchführen (Abb. 8). Im lipopolysaccharidinduzierten Sepsismodell der Ratte (LPS; Escherichia coli O55:B5; Sigma, Deisenhofen, Deutschland) ließen sich 3-dimensional quantitative Veränderungen des Lungengerüstes dokumentieren. Die Endotoxinperfusion führte zu einer Volumenzunahme des Interstitiums (58,09±4,6 µm3 vs. 8,31±1,63 µm3; p<0,001), die in erster Linie einem interstitiellen Ödem zugeordnet werden kann, mit begleitender Reduktion der lufthaltigen Volumens der Alveolen (49,74±1,72 µm3 vs.101,0±1,16 µm3; p<0,001) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Veränderungen der kapillaren Dichte und des kapillaren Volumens wurden nicht beobachtet [23].

Abb. 8a–d
figure 8

Transversale, hoch auflösende Rekonstruktion einer normalen (a) und einer mit Endotoxin (c) perfundierten Rattenlunge in der µCT. Nach Endotoxinperfusion zeigen sich eine erhebliche interstitielle Volumenzunahme (interstitielles Ödem) und eine Reduktion des lufthaltigen Alveolarvolumens. In der 3-dimensionalen Rekonstruktion lassen sich in der Kontrollgruppe (b) die Alveolarsepten (roter Stern) sowie die Alveolarlichtungen scharf abgrenzen (weißer Stern). Nach Endotoxinperfusion sind die Alveolarsepten (d, roter Stern) (ödematös) verdickt und die Volumina der Alveolarlichtung (weißer Stern) vermindert

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Fazit für die Praxis

Mit der µCT steht uns heute ein neues, schnelles und zuverlässiges Verfahren zur nichtdestruktiven Darstellung und kontinuierlichen morphometrischen Analyse von Weichgewebe, Parenchym und Gefäßen zur Verfügung. Verglichen mit konventionellen histomorphometrischen Verfahren bietet die µCT die Möglichkeit einer vollständigen und lückenlosen Quantifizierung von Gefäßparametern. Die Methode hat somit das Potenzial, die quantitative Histologie in der vaskulären Forschung speziell in der Analytik der Mikrozirkulation zu ergänzen, da funktionelle Veränderungen von Arteriolen und Kapillaren umfassend quantifiziert werden können. Im humanen und experimentellen Untersuchungsgut werden wesentlich detailliertere Untersuchungen intraparenchymatöser Gefäße, z. B. intramyokardialer Arterien, als bisher ermöglicht. Insbesondere segmentale Gefäßläsionen könnten primär mit der µCT lokalisiert und anschließend histologisch/immunhistologisch verifiziert werden, so dass dieses bislang noch teure Hilfsmittel künftig in bestimmten Körperregionen das Auge wissenschaftlich arbeitender Pathologen/-innen unterstützen und seine/ihre Hand führen könnte.