Muskeldystrophien stellen eine heterogene Gruppe von Erbkrankheiten mit progressiver Muskelschwäche und Atrophien dar. Gliedergürtelmuskeldystrophien (LGMD) weisen eine vorwiegende Beteiligung der Becken- und Schultergürtelmuskulatur auf, wobei Manifestationsalter und Schwere der Erkrankung sehr variabel sind. Derzeit sind insgesamt 21 genetisch definierte LGMD-Subtypen bekannt [4, 5].

Die distalen Myopathien, die unterschiedliche Manifestationen an distalen Muskelgruppen aufweisen, sind ebenfalls eine große Gruppe von Muskeldystrophien mit bislang 9 identifizierten Gendefekten [9]. Besteht die Schwäche bevorzugt in der Wadenmuskeln wird dies als Miyoshi-Myopathie klassifiziert. Bei Miyoshi-Myopathie-Patienten fanden sich Mutationen im Dysferlin-Gen [2, 7].

Kürzlich wurden rezessive Mutationen im Gen für Anoctamin 5 (ANO5, MIM608662) bei Patienten mit Gliedergürtelmuskeldystrophie (LGMD2L) und Miyoshi-Myopathie ohne Dysferlin-Defekte beschrieben [3, 6, 8]. Anoctamin 5 ist ein Protein mit 8 Transmembrandomänen, das zur Anoctamin-Familie gehört. Dominante Mutationen im ANO5 sind mit gnathodiaphysealer Dysplasie (GDD, MIM 166260) assoziiert [12]. Die genaue Funktion von Anoctamin 5 ist bislang unbekannt. Es besteht eine hohe Homologie zu anderen Anoctaminen dieser Proteinfamilie. Anoctamin 1 und 2 stellen kalziumaktivierte Chloridkanäle dar [10, 13]. Deshalb wird angenommen, dass auch das ANO5-Gen für einen kalziumaktivierten Chloridkanal kodiert.

In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir 5 deutsche Patienten mit ANO5-Mutationen, die die phänotypische Variabilität illustrieren. Es wurde eine neue Mutation im ANO5-Gen identifiziert.

Methoden

Bei Patienten mit bislang nicht identifizierter Muskeldystrophie mit deutlicher CK (Kreatinkinase)-Erhöhung (>5fach) und möglicher autosomal-rezessiver Vererbung wurden molekulargenetische Analysen des ANO5 -Gens vorgenommen. Sechs Patienten hatten eine LGMD als Phänotyp und 3 Patienten eine Miyoshi-Myopathie. Immunhistochemisch hatten sich keine Hinweise auf eine der bekannten Muskeldystrophien ergeben (Antikörper gegen Dystrophin, Emerin, die Sarkoglykane α, β, δ, γ, Laminin α2, die Dystroglykane, Dysferlin, Caveolin, Utrophin und Spektrin). Auch Westernblot-Untersuchungen mit Antikörpern gegen Dysferlin und Calpain 3 waren normal und die FKRP („fukutin-related protein gene“) -Mutation p.L276I war nicht nachweisbar gewesen.

Zur Identifikation der ANO5-Mutation c.191dupA wurde Exon 5 mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert und anschließend direkt sequenziert. Bei den Patienten, die nicht homozygot für die Mutation c.191dupA waren, wurden die Exone 13, und 20 mittels PCR amplifiziert und sequenziert. Bei dem Patienten, der keine zweite Mutation in Exon 5, 13 und 20 trug, wurde der gesamte kodierende Bereich des ANO5-Gens sequenziert (Primersequenzen werden gerne auf Anfrage zur Verfügung gestellt).

Bei allen Indexpatienten wurden eine Muskelbiopsie (Patientin 1: M. biceps brachii, Patient 2: M. vastus lateralis, Patient 3: M. rectus femoris, Patient 4: M. gastrocnemius) entnommen. Die histologische Aufarbeitung nach Standardmethoden umfasste die Färbungen bzw. Reaktionen Hämatoxylin-Eosin (HE), Gomori-Trichom, ATPase, Succinatdehydrogenase (SDH), Periodic-acid-schiff-Reaktion (PAS), Sudanschwarz und saure Phosphatase.

Ergebnisse

Klinische Fallbeschreibungen

Patientin 1

Eine 70-jährige Patientin klagt über Gangbeschwerden seit dem 64. Lebensjahr. Sie kippe häufig mit der linken Hüfte ab, außerdem sei ihr aufgefallen, dass der linke Oberschenkel dünner geworden sei (Abb. 1).

Abb. 1
figure 1

Patientin 1 mit Muskeldystrophie vom Gliedergürteltyp. Auffällig sind linksbetonte Atrophien am Oberschenkel und ein positives Trendelenburg-Zeichen links

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Untersuchungsbefund

Linksbetonte Atrophien der Oberschenkel, beinbetontes Gliedergürtelsyndrom mit Paresen der Armabduktion (Medical Research Council [MRC] 4), Beugung im Kniegelenk (MRC 4), Beinabduktion (MRC 3) und Hüftstreckung (MRC2). Trendelenburg-Zeichen beidseits nachweisbar, Aufrichten aus der Hocke nur mittels Gowers-Manöver, Zehen- und Hackengang erschwert. In der Familie keine Muskelbeschwerden. CK deutlich erhöht (30fach). Elektromyographie (EMG) mit myopathischen Veränderungen im M. biceps brachii und im M. vastus lateralis links, dort auch pathologische Spontanaktivität. Elektrokardiographie (EKG), Langzeit-EKG und Echokardiographie normal.

Patient 2

Ein 52-jähriger Patient beklagt seit 14 Jahren eine zunehmende Schwäche in den Armen und Beinen und Muskelschwund im Bereich der Oberschenkel, Waden und Beugeseiten der Ober- und Unterarme. Darüber hinaus werden Schmerzen in Ruhe und unter Belastung im Bereich des Schultergürtels und der Adduktoren beklagt. Treppensteigen gelinge nur mit Festhalten am Geländer, das Aufstehen aus der Hocke sei erschwert.

Untersuchungsbefund

Hüftgürtelparese (MRC 2–3). Linksbetonte Muskelatrophie der Ober- und Unterschenkelmuskulatur beidseits, Zehen- und Hackengang erschwert, monopedales Hüpfen verplumpt, Aufrichten aus der Hocke mit Gowers-Manöver. Trendelenburg-Gang. In der Familie keine Muskelerkrankung. CK um das 14fache erhöht. EMG von M. vastus med. und M gastrocnemius links myopathisch. Magnetresonanztomographie (MRT) der Oberschenkel beidseits ausgeprägte, linksbetonte fettige Degeneration der gesamten Oberschenkelmuskulatur beidseits ohne Ödem. EKG normal.

Patient 3a

Ein 56-jähriger Patient leide seit dem 40. Lebensjahr an einer langsam progredienten schmerzlosen linksbetonten Kraftminderung in den Beinen. Die Gehstrecke betrage 500 m, das Treppensteigen sei erschwert.

Untersuchungsbefund

Linksbetonte Parese im Hüftgürtel (MRC 4) ohne Atrophien, Aufstehen aus dem Liegen erschwert, Aufstehen aus der Hocke nur mit Gowers-Manöver, monopedales Hüpfen nicht möglich, Zehengang erschwert. CK 18fach erhöht. Familienanamnestisch keine Muskelerkrankung bekannt, bei der Schwester (Patientin 3b) jedoch persistierende CK-Erhöhung gemessen. MRT der Oberschenkel beidseits ausgeprägte, linksbetonte fettige Involution der Oberschenkelmuskulatur. M. rectus femoris und M. sartorius beidseits die einzigen normal dargestellten Muskeln (Abb. 2 b). M. sartorius beidseits Ödemsignal und Kontrastmittel (KM)-Enhancement. EMG des M. vastus lateralis rechts mit geringen Fibrillationen und gemischt myopathische und neurogene Willkürpotenziale. EKG und Echokardiographie normal.

Abb. 2
figure 2

a MRT der Ober- und Unterschenkel von Patientin 3b. b MRT des Oberschenkels von Patient 3a. c MRT des Unterschenkels von Patient 4

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Patientin 3b

Die 52-jährige Schwester von Patient 3a gibt an, dass sie beschwerdefrei ist. Sie habe weder eine Muskelschwäche noch Muskelschmerzen. In der klinischen Untersuchung keine Auffälligkeiten. CK persistierend erhöht (8- bis 11fach). Im MRT (Abb. 2 a) M. adductor longus und Caput mediale des M. gastrocnemius beidseits sowie M. biceps femoris rechtsseitig fettige Degeneration und Ödem. EMG M. biceps brachii rechts myopathisch.

Patient 4

Ein 29-jähriger Patient bemerkt erstmalig bei Märschen während seines Wehrdienstes im Alter von 23 Jahren Probleme in der linken Wade mit Verhärtung der Muskulatur. Es fand sich eine 16fach erhöhte CK. Seit einem halben Jahr würden zusätzlich Muskelschmerzen in Ober- und Unterschenkeln und Oberarmen auftreten, die sich unter Anstrengung verstärkten und eine zunehmende Verschmächtigung der linken Wade sei aufgefallen.

Untersuchungsbefund

Deutlich linksseitig betonte Wadenatrophie, in der Einzelkraftprüfung linksbetonte Schwäche der Fußsenkung (MRC 4), Zehengang nur rechts möglich, Hackengang bei Verkürzung der Achillessehnen erschwert, Kniebeuge regelrecht. Sensibilität intakt. Familienanamnestisch keine Muskelbeschwerden zu eruieren. CK 13fach erhöht. MRT der Unterschenkel (Abb. 2 c) im Caput mediale des M. gastrocnemius fettige Degeneration und Ödem auf beiden Seiten, links auch im Caput laterale des M. gastrocnemius sowie im M. soleus Signalanhebungen. EMG rechter M. gastrocnemius mit geringen Fibrillationen und Fazikulationen, Willkürpotenziale normal konfiguriert. EKG normal.

Myohistologische Untersuchungsergebnisse

Bei allen Indexpatienten zeigte sich in der Muskelbiopsie histologisch entweder ein geringgradiges (Patient 1, 2, 3a) oder ausgeprägtes (Patient 4) myopathisches Gewerbssyndrom (Abb. 3 a). Dieses ist gekennzeichnet durch eine Variabilität der Faserdurchmesser, durch das Auftreten von einzelnen oder mehreren binnenständigen Kernen und das Auftreten von Ringbinden (Patient 3a). Auffällig ist das gehäufte Vorkommen von verminderter oxidativer Enzymaktivität im Zentrum einzelner Muskelfasern sowie eine geringe Vermehrung von COX (Cyclooxygenase)-negativen Fasern (Abb. 3 b). Bei keinem Patienten fanden sich Hinweise für eine pathologische Glykogen- oder Lipidspeicherung oder Ragged-red-Fasern. Elektronenmikroskopisch fanden sich bei Patient 2 und 4 multifokale Lücken im Sarkolemm und an denselben Stellen ein Fehlen der Kostameren (Abb. 4).

Abb. 3
figure 3

a Die HE-Färbung (Vergr. 1:200) zeigt ein geringgradiges (Patienten 1 bis 3) bzw. ausgeprägtes (Patient 4) myopathisches Gewebssyndrom. b Die COX/SDH-Reaktion (Vergr. 1:50) zeigt eine leichte Vermehrung von COX-defizienten Fasern (Patient 1: 1%, Patient 2: 3%, Patient 3: 2%, Patient 4: 4%)

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Abb. 4
figure 4

Die Elektronenmikroskopie des Muskelgewebes (Vergr. 1:28.700) von a Patient 2 und b Patient 4 zeigt multifokale Lücken im Sarkolemm und an denselben Stellen ein Fehlen der Kostamere

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Molekulargenetische Ergebnisse

Die Mutation c.191dupA im ANO5-Gen ließ sich homozygot bei den Patienten 1 und 2 und heterozygot bei den Patienten 3a, 3b und 4 nachweisen (Abb. 5 a). Zusätzlich war bei Patient 4 die bereits beschriebene Mutation p.R758C (c.2272C>T) heterozygot nachweisbar [3, 6, 8]. Bei Patient 3a konnte eine neue Mutation p.T548I (c.1643C>T) heterozygot nachgewiesen werden (Abb. 5 b). Patientin 3b, die Schwester von Patient 3a, ist ebenso wie ihr Bruder „compound-heterozygot“ für die häufige Mutation c.191dupA und die neue Mutation p.T548I. Der gesunde Sohn von Patient 3a trägt nur die Mutation c.191dupA und die gesunde Tochter von Patient 3a nur die Mutation p.T548I.

Abb. 5
figure 5

a Sequenzierungselektropherogramm mit der „häufigen“ Mutation c.191dupA heterozygot. b Sequenzierungselektropherogramm mit einer neue Mutation c.1643C>T heterozygot (Rückwärtssequenz)

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Diskussion

Bisher sind bei 18 Familien mit LGMD-Phänotyp (3 französisch-kanadisch, 3 deutsch und 12 britisch) und 8 Familien mit distaler Myopathie Typ Miyoshi (3 britisch, 2 deutsch, 2 finnisch und 1 niederländisch) rezessive Mutationen im ANO5-Gen identifiziert worden [3, 6, 8]. Wir beschreiben 4 weitere deutsche Indexpatienten (3 mit LGMD und einen mit distaler Myopathie Typ Miyoshi) sowie eine asymptomatische Mutationsträgerin mit HyperCKämie. Die Identifikation von 4 Indexpatienten in unserem Kollektiv von 9 Patienten mit bislang ungeklärter Muskeldystrophie zeigt, dass die Erkrankung in Deutschland keine Rarität darstellt.

Ein Manifestationsalter nach der 2. Lebensdekade und eine deutliche HyperCKämie sind charakteristische Kriterien für eine Muskeldystrophie mit Anoctamin-5-Mutationen [3, 6]. Die 14- bis 30fache CK-Erhöhung bei unseren Patienten ist mit den bisher beschriebenen Fällen (2- bis 158fach) vergleichbar [3, 6]. Auch unsere Indexpatienten wiesen ein Manifestationsalter nach der 2. Lebensdekade auf. Im Unterschied zu den bisherigen Fällen mit Manifestationsalter zwischen der 3. und 6. Lebensdekade [3, 6] zeigt unsere Patientin 1, dass die Muskelschwäche auch erst in der 7. Lebensdekade auftreten kann. Alle 4 Indexpatienten zeigten eine asymmetrische Muskelbeteiligung, die mehr oder weniger deutlich in der klinischen Untersuchung auffiel und sich auch im MRT widerspiegelte, selbst bei der asymptomatischen Schwester. Die asymmetrischen motorischen Defizite scheinen charakteristisch für eine Muskeldystrophie durch Anoctamin-5-Mutationen zu sein und wurden in der Serie von Hicks et al. auch bei 18 von 20 Patienten beschrieben [6]. Eine Herzbeteiligung ist weder bei unseren Patienten noch in der Literatur beobachtet worden.

Einen typischen histopathologischen Befund bei Muskelbiopsien von Patienten mit ANO5-Mutationen scheint es nicht zu geben. Alle unsere Patienten weisen ein mehr oder minder stark ausgeprägtes myopathisches Gewebssyndrom auf (Abb. 3 a). Die auffälligen Veränderungen in der histochemischen Darstellung oxidativer Enzyme (Abb. 4 b) unabhängig vom Alter sind bisher noch nicht beschrieben, lassen sich aber auch nicht hinreichend durch Veränderungen eines Ionenkanals erklären oder darauf beziehen. Bisher ist es nicht möglich, die Diagnose immunhistochemisch zu stellen, da es keinen kommerziellen Antikörper gibt, der das Genprodukt erkennt. Die in der Erstpublikation [3] abgebildeten ultrastrukturellen Membrandefekte fanden sich auch in unserem Material sowohl bei der Gliedergürtelform als auch bei der distalen Form (Abb. 5). Die pathogenetische Bedeutung dieser Defekte bleibt jedoch unklar.

Die Genveränderung c.191dupA im Exon 5 ist eine häufige Mutation im ANO5-Gen. Diese Gründer-Mutation wurde bislang bei 24 Patienten mit LGMD2L oder distaler Myopathie identifiziert [3, 6]. Unsere 4 Indexpatienten trugen ebenfalls diese Mutation auf mindestens einem Allel (Tab. 1). Zusätzlich zu dieser häufigen Mutation wurden zwei andere Punktmutationen bei unseren Patienten identifiziert: Mutation p.R758C (c.2272C>T) im Exon 20 und Mutation p.T548I (c.1643C>T) in Exon 16. Die Mutation p.R758C wurde bereits bei 5 Patienten mit distaler Myopathie (4 Patienten homozygot, ein Patient heterozygot) beschrieben [3, 6, 8]. Unser Patient (Patient 4) mit dieser Mutation hatte ebenfalls einen distalen Phänotyp. Bei Patienten mit LGMD wurde diese Mutation bisher nicht identifiziert. Bislang wurde keine Genotyp-Phänotyp-Beziehung bei Muskeldystrophien durch Anoctamin-5-Mutationen beobachtet, Man kann aber spekulieren, dass solch eine Beziehung für die p.R758C-Mutation besteht und diese Mutation zu einer distalen Myopathie führt.

Die zweite Punktmutation p.T548I ist bislang nicht beschrieben und erweitert das Spektrum der Anoctamin-5-Mutationen. Die Untersuchung von zwei Nachkommen von Patient 3a zeigte, dass die Mutationen p.T548I und c.191dupA in Familie 3 auf unterschiedlichen Allelen liegen und somit beim Patienten selbst compound-heterozygot sind. Für die Pathogenität der neuen Mutation p.T548I sprechen, dass

  • die Mutation nicht als SNP („single nucleotide polymorphism“) beschrieben wurde [11],

  • die Aminosäure Threonin bei verschiedenen Spezies an Position 548 hoch konserviert ist (Abb. 6),

  • es zu einem Austausch von einer polaren zu einer nichtpolaren Aminosäure kommt und

  • das Prädiktionsprogramm „PolyPhen“ eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit der Pathogenität voraussagt (Score 0,999; [1]).

 

Tab. 1 Klinische und genetische Daten von 4 Indexpatienten und einer asymptomatischen Schwester (3b) mit Anoctamin-5-Mutationen
Full size table
Abb. 6
figure 6

Vergleich der Aminosäuresequenz im Bereich der Position 548 des Anoctamin-5-Proteins bei verschiedenen Spezies

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Fazit für die Praxis

Bei Patienten mit einer Muskeldystrophie (insbesondere mit asymmetrischer Muskelbeteiligung), deutlicher HyperCKämie und Erstmanifestation im Erwachsenenalter (bis in die 7. Lebensdekade) sollte an eine Muskeldystrophie durch rezessive Anoctamin-5-Mutationen gedacht werden, die erst kürzlich identifiziert wurden. Die Erkrankung scheint eine relativ häufige Ursache einer Muskeldystrophie in Deutschland zu sein, die sich sowohl als Gliedergürtelsyndrom als auch als distale Myopathie der Waden manifestieren kann. Die Diagnose kann derzeit nur molekulargenetisch gestellt werden, da eine Antikörperuntersuchung (Immunhistologie oder Westernblot) nicht verfügbar ist. Die molekulargenetische Analyse kann als Stufendiagnostik erfolgen (Untersuchung der häufigen Mutation c.191dupA vor einer Sequenzierung des ANO5-Gens).