Abstract
The immunogold-silver staining technique was developed for the light microscopical localization of viral antigen in plant tissue. Semi-thin sections of LR White-embedded plant tissue were immunologically labelled with primary antiserum and protein A-gold. Individual gold particles were covered with a silver precipitate using a physical developer. This precipitate could be seen as black spots in a conventional light microscope with brightfield and as brilliant white spots with darkfield illumination. Maximal sensitivity and low background was obtained when immunogold-labelled sections were fixed in glutaraldehyde prior to silver enhancement. Simultaneous observation of the silver coated gold label and cell morphology was achieved by epipolarization microscopy. Using this technique cowpea chlorotic mottle virus coat protein was detected in cowpea plants as function of the infection period. Virus translocation and multiplication was monitored in systemically inoculated tissue, showing viral antigen in phloem parenchyma of petiolules 6 h after systemic inoculation and subsequent spreading from the phloem to the neighbouring bundle sheath and cortex cells.
Samenvatting
De immunologische techniek (IGSS), waarbij complexen van antilichamen met proteïne A geadsorbeerd aan kolloïdaal goud (pAg) worden bedekt met zilver, werd met succes toegepast voor het aantonen van viraal antigeen in geïnfecteerd planteweefsel met behulp van de lichtmicroscoop. Semi-dunne plakjes weefsel werden ingebed in LR White en behandeld met antiserum tegen het ‘cowpea chlorotic mottle’ virus (CCMV). Aan dit antigeen-antilichaam complex werd pAg gehecht. Vervolgens werd op de individuele gouddeeltjes zilver neersgeslagen met een ontwikkelaar bestaande uit een mensel van zilverlactaat en hydroquinone. De gouddeeltjes katalyseren de reductie van de zilverionen in oplossing tot metallisch zilver, dat neerslaat op de gouddeeltjes. Het zilverprecipitaat is waarneembaar als zwarting in een lichtmicroscoop met doorvallend licht en licht wit op bij donkerveld belichting. Maximale gevoeligheid van detectie en lage achtergrondkleuring werden bereikt door fixatie van het antigeen-antilichaam-pAg complex met glutaaraldehyde vóór de zilverkleuring.
Gelijktijdige waarneming van het zilver label en de morfologie van de cellen was mogelijk door toepassing van gepolarisserd licht in een microscoop met opvallende belichting (epipolarisatiemicroscopie) in combinatie met doorvallend licht. Het zilverprecipitaat is hierbij waarneembaar als een helder blauwe kleur door de weerkaatsing en verstrooiing van het gefiltreerde gepolariseerde licht, terwijl de morfologie van de cytochemisch gekleurde cellen zichtbaar is met doorvallende belichting. Met IGSS in combinatie met epipolarisatiemicroscopie werd het CCMV gelokaliseerd in cowpea planten als functie van de infectieduur. De translocatie en vermenigvuldiging van het virus werden gevolgd in planteweefsel dat systemisch was geïnoculeerd volgens de differentiële-temperatuur-inoculatietechniek. Zes uur na systemische inoculatie werd het virus voor het eerst waargenomen in enkele floeemparenchymcellen en de infectie breidde zich daarna snel uit. Vierentwintig uur na inoculatie kon virus worden aangetoond in grote delen van het floeem, in de bundelschede en in de aangrenzende delen van de schors. Concluderend kan worden gesteld dat het virus vanuit de primaire bladeren naar de secundaire bladeren werd getransporteerd via het floeem, analoog aan het transport van assimilaten.
Tot slot werden dunne plakjes geïnfecteerd weefsel, geïncubeerd met antiserum en proteïne A-goud, na zilverbehandeling vergeleken in licht-en elektronenmicroscoop.
Article PDF
Similar content being viewed by others
Avoid common mistakes on your manuscript.
References
Danscher, G., 1981. Localization of gold in biological tissue. A photochemical method for light and electron microscopy. Histochemistry 71: 81–88.
Danscher, G. & Nörgaard, J.O.R., 1983. Light microscopic visualization of colloidal gold on resin-embedded tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 31: 1394–1398.
Dawson, W.O. & Schlegel, D.E., 1976. Synchronization of cowpea chlorotic mottle virus replication in cowpea leaves. Intervirology 7: 284–291.
De Brabander, M., Geuens, G., Nuydens, R., Moeremans, M. & De Mey, J., 1985. Probing microtubule-dependent intracellular motility with nanometer particle video ultramicroscopy (Nanovid ultramicroscopy). Cytobios 43, 273–283.
De Mey, J., 1983. Colloidal gold probes in immunocytochemistry. In: J.M. Polak and S. van Noorden (Eds), Immunocytochemistry. Practical applications in pathology and biology. Wright. PSG, Bristol, 82–112.
De Mey, J., Hacker, G.W., De Waele, M. & Springall, D.R., 1986. Gold probes in light microscopy. In: J.M. Polak and S. van Noorden (Eds), Immunocytochemistry. Modern methods and applications. 2nd edn., Wright. PSG, Bristol, 71–88.
Geoghegan, W.D., Scillian, J.J. & Ackerman, G.A., 1978. The detection of human B-lymphocytes by both light and electron microscopy utilizing colloidal gold-labelled anti-immunoglobulin. Immunological Communications 7: 1–12.
Hacker, G.W., Springall, D.R., Van Noorden, S., Bishop, A.E., Grimelius, L. & Polak, J.M., 1985. The immunogold-silver staining method. A powerfull tool in histopathology. Virchows Archives [Pathol. Anat.] 406: 449–461.
Holgate, C.S., Jackson, P., Cowen, P.N. & Brid, C.C., 1983. Immunogold-silver staining: New method of immunostaining with enhanced sensitivity. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 31: 938–944.
Huang, W.M., Gibson, S.J., Facer, P., Gu, J. & Polak, J.M., 1983. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry 77: 275–279.
Lackie, P.M., Hennessy, R.J., Hacker, G.W. & Polak, J.M., 1985. Investigation of immunogoldsilver staining by electron microscopy. Histochemistry 83: 545–550.
Lei, J.D. & Agrios, G.N., 1986. Detection of virus infection and spread by immunofluorescent staining of enzyme treated leaves. Phytopathology 76: 1031–1033.
Lent, J.W.M. van & Verduin, B.J.M., 1986. Detection of viral protein and particles in thin sections of infected plant tissue using immunogold labelling. In: R.A.C. Jones and L. Torrance (Eds), Developments in applied biology. 1. Developments and applications in virus testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K., 193–211.
Moeremans, M., Daneels, G., Van Dijck, A., Langanger, G. & De Mey, J., 1984. Sensitive visualization of antigen-antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold/silver staining. Journal of Immunological Methods 74: 353–360.
Patterson, S. & Verduin, B.J.M., 1987. Applications of immunogold labelling in animal and plant virology. Archives of Virology, in press.
Roth, J., 1983. The colloidal gold marker system for light and electron microscopic cytochemistry. In: G.R. Bullock and P. Petrusz (Eds), Techniques in immunocytochemistry, vol. II. Academic Press, London, 217–284.
Author information
Authors and Affiliations
Rights and permissions
About this article
Cite this article
Van Lent, J.W.M., Verduin, B.J.M. Detection of viral antigen in semi-thin sections of plant tissue by immunogold-silver staining and light microscopy. Netherlands Journal of Plant Pathology 93, 261–272 (1987). https://doi.org/10.1007/BF01998201
Accepted:
Issue Date:
DOI: https://doi.org/10.1007/BF01998201